论文摘要
背景:近年来,反义技术广泛地应用于肿瘤基因治疗的研究中,随着基因组学、蛋白组学的研究,已筛选出部分在肿瘤转化、发展过程中的靶基因可作为治疗的靶标。有学者发现,缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是介导肿瘤细胞缺氧适应的关键性转录调控因子,在多种恶性实体瘤中高表达。HIF-1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子（VEGF）、红细胞生成素（EPO）等的表达,维持肿瘤细胞的能量代谢,影响新血管的生成,促进肿瘤的增殖和转移。血管内皮生长因子（VEGF）在内皮生长及肿瘤发生中具有重要作用,肿瘤的生长和扩散转移与血管生成密切相关。因此,HIF-1α可能是肿瘤基因治疗中一个极具潜力的靶点。目的:应用HIF-1α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）来处理体外培养的宫颈癌Hela细胞,研究反义脱氧寡核苷酸封闭HIF-1α基因对体外宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF-1α、VEGF表达的影响,力求为今后进行针对HIF-1α的妇科肿瘤基因治疗探寻一条新的可行途径。方法:1、对体外培养的宫颈癌Hela细胞进行转染。实验分为HIF-1α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）组、HIF-1α正义脱氧寡核苷酸（SODN）组、脂质体对照组及空白对照组。2、采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法,检测HIF-1αASODN对体外宫颈癌Hela细胞株增殖的影响。3、应用间接免疫荧光技术检测ASODN组、SODN组、脂质体对照组及空白对照组细胞HIF-1α和VEGF的表达。4、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达。5、蛋白印迹（Western blot）技术检测各组细胞HIF-1α和VEGF的蛋白表达,了解HIF-1α基因的沉默效果。6、所得数据应用SPSS11.5统计分析软件进行分析。结果:1、反义脱氧寡核苷酸（ASODN）转染后24h即对宫颈癌Hela细胞发生明显的生长抑制作用,与正义脱氧寡核苷酸（SODN）组、脂质体（LIPOFECTAMINETM 2000）对照组比较,抑制率差异有统计学意义（P均<0.01）。反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用呈现剂量依赖性,随药物浓度增加抑制作用增强。2、RT-PCR及Western blot结果显示, ASODN处理组细胞HIF-1α及VEGF基因表达与SODN组、脂质体对照组及空白对照组比较,表达量明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明ASODN特异性抑制了HIF-1α的基因表达。3、间接免疫荧光技术检测HIF-1α在胞浆及胞核中均着色,而VEGF着色主要分布在胞浆。ASODN处理组细胞HIF-1α及VEGF的荧光强度均明显弱于对照组,说明ASODN对HIF-1α及VEGF的表达有明显的抑制作用。此结果与RT-PCR及Western blot的分析结果一致,进一步为ASODN对HIF-1α和VEGF的基因表达具有抑制作用提供了实验依据。结论:1、HIF-1α在胞浆及胞核中均表达,而VEGF仅在胞浆中表达。2、脂质体转染HIF-1αASODN具有明显抑制宫颈癌Hela细胞的增殖活性及下调HIF-1α、VEGF基因表达的作用。3、HIF-1αASODN转染可以作为宫颈癌治疗的一种新思路。
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标签：宫颈肿瘤论文; 缺氧诱导因子论文; 反义脱氧寡核苷酸论文; 血管内皮生长因子论文; 细胞论文;