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口蹄疫DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C免疫原性的初步研究

2020-11-30阅读(795)

口蹄疫DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C免疫原性的初步研究

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouthdisease virus,FMDV）引起偶蹄动物的最烈性传染病之一。目前FMD呈世界范围流行趋势。特别是近几年来O型、A型和AsiaⅠ型FMD在我国周边国家或东南亚地区时有发生,对我国养殖业构成了严重的威胁。以本室构建的复合多表位表达盒OAAT及AsiaⅠ型FMDV的P1-2A-3C为基础构建了FMDV核酸疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C。用限制性酶切对其进行了鉴定。该DNA疫苗转染HeLa细胞表达的蛋白在间接免疫荧光（IFA）检测中与O型FMDV多克隆血清和AsiaⅠ型FMDV多克隆血清均能结合,在FITC标记的二抗作用下经伊文斯兰染色可见较好的绿色荧光。以BALB/c小鼠为试验动物,应用该DNA疫苗对小鼠进行免疫接种后,检测体液与细胞免疫指标。研究结果表明,pIRES-OAAT-P1-2A-3C及灭活苗免疫组的小鼠均能产生特异性抗体（与对照组相比,p＜0.05）。pIRES-OAAT-P1-2A-3C免疫组抗AsiaⅠ、O抗体效价,低于灭活疫苗免疫组。但均高于空质粒pIRElneo对照组及PBS对照组（p＜0.01）。流式细胞仪检测所得数据统计学分析结果表明,与灭活苗、空质粒pIRElneo对照组及PBS对照组比较,用所构建的DNA重组体DNA疫苗免疫的试验组小鼠的T淋巴细胞亚类CD4+和CD8+的数量显著提高（p＜0.05）。而各对照组之间差异不显著。用ELISPOT检测小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ斑点数试验结果表明,pIRES-OAAT-P1-2A-3C免疫组IFN-γ斑点数量（64.726）较灭活苗（39.625）显著增多（p＜0.05）。而各对照组之间差异不显著。应用MTT法检测淋巴细胞增殖结果显示,pIRES-OAAT-P1-2A-3C和灭活苗组小鼠T淋巴细胞均出现较明显的特异性和非特异性增殖反应。且pIRES-OAAT-P1-2A-3C组增殖能力强于灭活疫苗组（p＜0.05）。给豚鼠进行2次免疫,用250ID50的FMDV进行攻击,观察其保护效果。灭活疫苗组4只豚鼠均未出现任何FMD症状,表明获得完全保护。pIRES-OAAT-P1-2A-3C组有2只获得完全保护。说明该疫苗具有一定保护效果。上述结果证实了表达盒OAAT与P1-2A-3C的表达组合在鼠体内的良好的免疫原性。为其它载体应用该组合进行疫苗研制提供了试验依据。为研制有效的口蹄疫多价苗的作了一定的试验准备并提供物质储备。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 1 口蹄疫病毒分子生物学特性研究进展
  • 2 FMDV诊断技术研究进展
  • 3 FMDV疫苗研究进展
  • 试验材料
  • 1 菌株、质粒、细胞和病毒
  • 2 酶与试剂
  • 3 主要仪器
  • 4 各种溶液及培养基
  • 5 试验动物
  • 方法
  • 1 DNA疫苗构建
  • 1.1 构建思路及设计
  • 1.2 pIRES-OAAT的构建
  • 1.3 pIRES-OAAT-P1-2A-3C的构建
  • 2 pIRES-OAAT-P1-2A-3C基因DNA重组体的鉴定
  • 2.1 限制性内切酶酶切鉴定同
  • 2.2 重组体转染细胞
  • 2.3 间接免疫荧光（IFA）
  • 2.4 RT-PCR鉴定
  • 3 口蹄疫病毒价DNA疫苗免疫原性的初步研究
  • 3.1 重组体的大量制备和纯化同
  • 3.2 动物试验
  • 3.3 豚鼠试验
  • 结果
  • 1 DNA疫苗构建与鉴定
  • 1.1 pIRES-OAAT的酶切鉴定
  • 1.2 pIRES-OAAT-P1-2A-3C的酶切鉴定
  • 1.3 DNA重组体的IFA检测结果
  • 1.4 重组病毒的RT-PCR鉴定
  • 2 动物试验结果
  • 2.1 ELISA检测结果
  • 2.2 细胞亚类数量的检测结果
  • 2.3 T淋巴细胞增殖试验结果
  • 2.4 免疫小鼠单细胞水平IFN-γ的分泌
  • 2.5 豚鼠攻毒保护率
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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