三疣梭子蟹养殖塘水体可培养微生物多样性的研究

论文摘要

可培养微生物在养殖池塘的物质循环、能量流动、生态平衡及环境净化等方面起着十分重要的作用,与蟹病的发生与防治密切相关。本文将传统分离培养方法与聚合酶链反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和核酸序列测定等现代分子生物学技术相结合,对三疣梭子蟹进水塘和养殖塘环境中的可培养微生物多样性进行了研究。本实验研究内容主要包括三部分:第一部分基于形态结构特征上的可培养微生物分群研究。10月份在三疣梭子蟹养殖池塘水体中分离240株细菌,根据菌落特征分成15个类群,其中有3个优势类群,5个较丰富类群和7个稀有类群。再依据菌体特征分为31个亚群,其中球杆状亚群是最优势亚群;结果表明进水塘和养殖塘的优势类群和亚群组成存在差别,当进水塘水体进入养殖塘后,其优势菌菌群和亚群都发生了显著改变;第二部分为可培养微生物遗传多样性的研究。建立实验分离到得可培养微生物的DGGE指纹数据库,同时测定了相应的16S rDNA序列并分析了它们的系统发育学地位。结果表明实验分离到得可培养微生物分为73个系统发育型,分布于细菌域中的3个门7个纲16个科中的大约20个属。涵盖菌株数最多的4个属为:Bacillus属、Vibrio属、Halobacillus属、Stenotrophomonas属。通过对比发现进水塘和养殖塘的优势菌种发生变化,并且进水塘的菌种多样性多于养殖塘。第三部分为养殖水体功能微生物菌群的研究。对上述菌株进行了转化氮、磷、硫元素化合物生态功能试验和酪蛋白酶,胶原蛋白酶,卵磷脂酶的生理生化实验。对它们在养殖环境内源污染中的作用进行了初步探讨。其中代谢硫化合物产H2S、还原硝酸盐和降解有机磷化合物的主要成员是Vibrio属的细菌。Bacillus属的细菌是还原亚硝酸盐和降解无机磷主要成员。实验中发现了具有多种生态功能的菌株,主要以Vibrio、Stenotrophomonas和Bacillus属为主。能够分泌多种胞外酶的菌株,主要以Vibrio、Stenotrophomonas和Bacillus属为主。它们为养殖池塘的有机物循环贡献力量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 导论
• 1.1 微生物多样性的涵义
• 1.1.1 分类多样性
• 1.1.2 系统发育多样性
• 1.1.3 遗传多样性
• 1.1.4 功能多样性
• 1.2 微生物多样性的研究方法概述
• 1.2.1 鉴定微生物的经典方法
• 1.2.2 纯培养不依赖法
• 1.3 养殖水域微生物多样性的研究现状
• 1.4 本论文的研究目的及研究内容
• 第2章 基于形态结构特征上的异养细菌分群研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 采样地点
• 2.2.2 样品采集
• 2.2.3 理化因子的测定
• 2.2.4 细菌的培养及计数
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 细菌的分离、纯化及分群
• 2.3 结果及讨论
• 2.3.1 理化因子测定结果
• 2.3.2 养殖池塘可培养细菌数量
• 2.3.3 基于菌落形态上的分群研究
• 2.3.4 基于菌体形态上的亚群归类分析
• 2.3.5 讨论
• 第3章 可培养异养细菌的遗传多样性研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 DNA 模板的制备
• 3.2.2 变性梯度凝胶电泳
• 3.2.3 细菌16S rDNA 全序列克隆
• 3.2.4 细菌16S rDNA 序列的测定
• 3.2.5 细菌16S rDNA 序列的系统发育学分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PCR-DGGE 方法体系的建立与优化
• 3.3.2 DNA 制备方法的选择
• 3.3.3 A、B、D 类群球杆亚群（A、B、D-SpR）遗传多样性研究
• 3.3.4 A、B、D 类群短杆亚群（A、B、D –SR）遗传多样性研究
• 3.3.5 C、E、G 类群球杆状亚群（C、E、G- SpR）遗传多样性研究
• 3.3.6 C、E、G 类群短杆亚群（C、E、G-SR）遗传多样性研究
• 3.3.7 H、I、J、K 类群（H、I、J、K-亚群）遗传多样性研究
• 3.3.8 F 类群（F-类群）遗传多样性研究
• 3.3.9 L、M、N、O 类群（L、M、N、O-类群）遗传多样性研究
• 3.3.10 A、B、D 类群长杆丝状亚群（A、B、D–LFR）遗传多样性研究
• 3.4 小结
• 第4章 养殖塘水体可培养生态功能和细菌胞外酶的研究
• 4.1 养殖塘水体可培养生态功能的研究
• 4.1.1 引言
• 4.1.2 材料与方法
• 4.1.3 结果与讨论
• 4.1.4 小结
• 4.2 养殖池塘水体可培养细菌生理生化研究
• 4.2.1 引言
• 4.2.2 试剂和方法
• 4.2.3 结果与讨论
• 4.2.4 小结
• 第5章 结论
• 5.1 可培养异养细菌的形态结构多样性
• 5.2 三个大亚群细菌的系统发育型的多样性
• 5.3 可培养细菌可能在养殖塘氮、磷、硫素转化中起重要作用
• 5.4 可培养细菌可能在养殖塘有机物转化中起重要作用
• 5.5 PCR-DGGE 方法体系的评价
• 5.6 菌落特征指标作为微生物多样性初筛标准的评价
• 参考文献
• 致谢