斑点叉尾鮰干扰素α基因的克隆和原核表达及生物活性初探

论文摘要

本试验根据Genbank上已发表的斑点叉尾鲴干扰素（IFN-α）基因序列（AY267538）设计并合成了特异性引物,取新鲜斑点叉尾鮰外周淋巴血并分离淋巴细胞,以草鱼出血病病毒（GCHV）诱导后的淋巴细胞提取其总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出492bp的目的片段,将其克隆到pMD18-T载体上,经酶切鉴定和序列测定证明该序列是斑点叉尾鮰IFN-α。斑点叉尾鮰IFN-α开放阅读框由492个核苷酸组成,推测其编码产物由164个氨基酸组成。经核酸序列分析比对后发现,斑点叉尾鮰IFN-α与Genbank已发表的鲶鱼干扰素（IFN-α）序列的同源性较高,为96.5%,氨基酸的同源性为92.6%。在NCBI上的登录号为EU783919。将克隆的斑点叉尾鮰IFN-α的成熟肽基因亚克隆到原核表达载体pET-32（a）+的EcoRⅠ、YhoⅠ位点上,构建重组表达载体pET-32（a）+CC-IFN-α。将酶切鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞,通过不同温度、时间诱导表达重组IFN-α蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在相对分子质量约为39kD（融合蛋白）处有明显的蛋白质表达条带,在30℃、5h表达产物最高,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的48.4%左右,而未经诱导的pET-32（a）+CC-IFN-α在39 kD处无条带产生。洗涤表达的IFN-α包涵体并用细胞病变抑制法检测其抗病毒活性法,通过实验表明所获得的重组斑点叉尾鮰IFN-α具有抗病毒反应活性,具有一定的生物学活性。本实验克隆出斑点叉尾鮰IFN-α基因,并原核表达出斑点叉尾鮰IFN-α蛋白,并首次引入国际标准方法用于检测斑点叉尾鮰干扰素的活性。为进一步研究斑点叉尾鮰IFN-α在体内外的作用及将其作为目前国内斑点叉尾鮰的病毒病预防和控制应用于临床提供了物质基础;与此同时,也为国内水产药品朝着无污染、无残留、安全的方向发展提供了一定的方向指引。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.IFN和IFN系统
• 1.1 IFN的分类以及基本性质
• 1.2 IFN的生物学活性
• 1.3 干扰素的分子结构
• 2.鱼类IFN的发现和鉴定
• 2.1 鱼类IFN系统研究历程
• 2.2 鱼类IFN及IFN系统
• 2.3 鱼类IFN系统的其他相关基因
• 2.4 鱼类IFN系统和鱼类病毒病
• 3.结语
• 第二章 斑点叉尾鮰IFN-α基因的克隆与序列分析
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 斑点叉尾鮰外周血淋巴细胞的分离与培养
• 2.2 斑点叉尾鮰外周血淋巴细胞总RNA的提取
• 2.3 RT-PCR扩增斑点叉尾鮰IFN-α基因
• 2.4 斑点叉尾鮰IFN-α基因克隆与测序
• 2.5 斑点叉尾鮰IFN-α基因生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 斑点叉尾鮰IFN-α基因RT-PCR产物
• 3.2 斑点叉尾鲴IFN-α基因重组质粒的双酶切电泳和PCR鉴定
• 3.3 斑点叉尾鮰IFN-α基因重组质粒的序列测定
• 3.4 斑点叉尾鮰IFN-α基因生物信息学分析
• 4 讨论
• 4.1 淋巴细胞培养和斑点叉尾鮰IFN-α的诱导
• 4.2 高纯度RNA的获得和防止RAN的降解
• 4.3 鱼类IFN-α的相关研究
• 第三章 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白的原核表达及其生物活性检测
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 IFN抗病毒检测用鸡胚、细胞和病毒
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白基因扩增与克隆载体的构建
• 2.2 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白基因重组表达质粒的构建
• 2.3 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白基因重组表达质粒的诱导表达
• 2.4 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白原核表达条件的优化
• 2.5 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白的Western-blot鉴定
• 2.6 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白生物学活性测定
• 3 结果
• 3.1 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白基因扩增及克隆载体的构建
• 3.2 斑点叉尾鮰IFN-α成熟蛋白基因原核表达质粒的构建
• 3.3 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白的诱导表达和可溶性检测
• 3.4 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白原核表达条件的优化
• 3.5 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白Western-blot鉴定
• 3.6 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白的生物学活性检测结果
• 4 讨论
• 4.1 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白表达载体的选择
• 4.2 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白表达条件的优化
• 4.3 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白的纯化
• 4.4 斑点叉尾鮰IFN-α重组成熟蛋白的应用前景
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录