论文摘要
Trxs是一类小分子量硫氧还蛋白,对维持细胞的氧化还原状态的平衡起重要作用。通过对其靶蛋白的调控,在机体代谢,神经保护,和免疫反应等过程中发挥重要生理功能。Trxs蛋白都包含一个含有CXXC序列的活性位点,在NAPDH和TrxR的作用下,可催化还原靶蛋白,近年来的研究发现,Trxs还具有转硝基和去硝基化功能。Trx2是特异定位于线粒体中的硫氧还蛋白。线粒体是细胞的能量工厂,是电子传递和氧还磷酸化主要发生的细胞器。线粒体参与细胞凋亡的发生。细胞在受到凋亡压力时,线粒体会释放线粒体膜间质中的凋亡蛋白,如细胞色素C, AIF等到细胞质中,起始下游凋亡途径。其次线粒体的膜内外压的减小或丧失被认为是线粒体诱导的不可逆的凋亡。线粒体正常功能的行使为维持细胞生理功能所必需。线粒体代谢过程中可聚集大量的活性氧（ROS）, Trx2、 TrxR2以及NAPDH,承担着线粒体内ROS的清除的职责。大量的数据表明了Trx2的抗凋亡功能,过表达Trx2能够保护TBH诱导的骨肉瘤细胞毒性。Trx2能够通过增加线粒体膜内外压,抵抗etoposide诱导的细胞死亡。在DT40细胞中敲除Trx2,可引起ROS水平的升高和细胞凋亡。Trx2在胚胎发育过程中的作用研究较少。在小鼠中纯合敲除Trx2导致胚胎致死。杂合敲除的小鼠,虽然不影响小鼠的生长和繁殖,但是小鼠肝脏的DNA,蛋白质以及脂类物质积累较多的氧化损伤。在受到氧化压力的刺激下,Trx2（+/-）敲除鼠肝脏发生更多的凋亡。在多种组织中,线粒体生产ATP的能力下降并且有更多的ROS产生。本论文中我们利用斑马鱼这一模式生物,对该基因在生物体内肝脏发育的作用进行研究。通过定量和原位杂交的方式,我们首先研究了Trx2在斑马鱼中时空表达,发现Trx2在肝脏中显著表达。利用morphlino技术,我们设计并合成了两个不同方式抑制Trx2表达的MO,通过显微注射的方法在斑马鱼中对Trx2的表达进行抑制,我们发现肝脏发育受到影响。进一步的TUNEL和免疫荧光试验提示Trx2敲低诱导肝脏细胞死亡而对增殖影响较小。一些研究结果表明Trx2在线粒体中除了清除ROS以外,很可能参与线粒体中硝基化蛋白的去硝基化过程。我们利用生物素转换方法,在体内和体外实验中发现,肝脏细胞死亡的发生和GAPDH硝基化增多有关,我们在HepG2细胞中的试验结果进一步表明,GAPDH的硝基化增多会引起更多的GAPDH入核并且导致p53活性位点lys乙酰化增多。活化的p53起始下游bax和puma基因表达增加。bax和puma是线粒体促凋亡基因,它们的表达失调可能和肝脏细胞死亡发生有关。在斑马鱼中我们同样发现morphlino敲低Trx2后bax和puma表达量同样升高。至此,我们提出了一个可能的新的Trx2导致凋亡的机制,这种机制提示了Trx2在早期肝脏器官发育过程中可能起重要功能。