川西高原药用植物内生放线菌的分离鉴定及抑菌活性研究

论文摘要

放线菌是一类重要的微生物资源,放线菌产生的大量生理活性物质,可作为抗菌剂、酶与酶制剂、抗病毒、抗肿瘤剂的来源。目前人们已完成了大量抗生素筛选工作,放线菌产生的新抗生素越难被发现,因此开始从不同的材料中寻找新的抗生素。植物中的内生放线菌与宿主在进化历程中长期共生,形成了独特的遗传和代谢体系,内生放线菌能够产生结构新颖、生物活性多样的次生代谢产物,药用植物内生放线菌在医药、农林、环境保护及工业等领域具有广阔的应用前景。本实验对药用植物内生放线菌的分离进行研究。利用4种选择性培养基,9种碳源,对采自四川西部高原地区的10种药用植物进行内生放线菌的分离。共计分离214株内生放线菌。不同植物,不同分离部位获得的内生放线菌数目均有较大差异。各种培养基的分离效果不同。改良高氏二号培养基和腐殖酸培养基分离效果较好。培养基抑制剂组合为：50μl/ml重铬酸钾和100μl/ml放线菌酮。这组抑制剂能够较好的抑制杂菌,对放线菌的生长影响较小。选择50株内生放线菌,检测其对3种植物病原菌抑菌效果,结果表明大多数内生放线菌能不同程度的抑制植物病原菌的生长。40株内生放线菌对植物病原菌产生抑制,17株内生放线菌对至少两种植物病原菌有抑制作用,其中Y3101和Y3104,对三种植物病原菌均有抑制作用。这两株菌分离自鼠尾草。抑菌试验说明供试药用植物内生放线菌菌株能够拮抗植物病原菌,具有产生新的活性物质的潜力。通过形态特征、培养特征对内生放线菌类群进行分析,发现大多数内生放线菌为链霉菌属(Streptomyces)。对14株抑菌效果较好的内生放线菌,结合表型特征观察以及16S rDNA全序列分析,进行了初步鉴定。通过构建系统发育树,初步确定菌株的分类地位：Y3056被鉴定为黑色链霉菌(Streptomyces niger), Y3057为浅多色链霉菌(Streptomyces pluricolorescens), Y3066为天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor), Y3069为桑普逊链霉菌(Streptomyces sampsonii)，Y3078为土味链霉菌(Streptomyces odor ifer), Y3083为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei), Y3087为细黄链霉菌(Streptomyces microflavus), Y3095为环圈链霉菌(Streptomyces anulatus), Y3099为淤泥链霉菌(Streptomyces limosus), Y3101为褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus),Y3103为杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus), Y3104为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus), Y3106为沙场链霉菌(Streptomyces arenae), Y3109为脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliatus)。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物内生菌
• 1.2 植物内生放线菌的研究进展
• 1.2.1 植物内生放线菌
• 1.2.2 植物内生放线菌的多样性
• 1.2.3 植物内生放线菌的分类鉴定
• 1.3 内生放线菌的应用
• 1.3.1 内生放线菌的抗菌活性
• 1.3.2 内生放线菌的抗虫活性
• 1.3.3 内生放线菌的除草活性
• 1.4 植物内生放线菌研究中存在的问题及展望
• 2 本试验研究的目的、意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 病原菌菌株
• 3.1.4 试验试剂及主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 药用植物的采集及预处理
• 3.2.2 药用植物内生放线菌的分离
• 3.2.2.1 样品的表面消毒
• 3.2.2.2 表面消毒效果检查
• 3.2.2.3 培养基和抑制剂的确定
• 3.2.2.4 内生放线菌的分离培养
• 3.2.2.5 内生放线菌的纯化
• 3.2.2.6 菌株的保藏
• 3.3 内生放线菌抑菌活性试验
• 3.4 药用植物内生放线菌的鉴定
• 3.4.1 表型鉴定
• 3.4.2 内生放线菌16S rDNA系统发育分析
• 3.4.2.1 放线菌基因组DNA的提取
• 3.4.2.2 16S rDNA的PCR扩增
• 3.4.2.3 16S rDNA全序列测定
• 3.4.2.4 16S rDNA序列分析和系统发育树的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 表面消毒效果检验
• 4.2 抑制剂对微生物的影响
• 4.3 内生放线菌的分离结果
• 4.4 内生放线菌的抑菌实验
• 4.5 内生放线菌的表型观察
• 4.6 内生放线菌的分子鉴定
• 4.6.1 内生放线菌菌株系统发育树
• 5 结论与讨论
• 5.1 药用植物内生放线菌分离结果讨论
• 5.2 药用植物内生放线菌抑菌作用讨论
• 5.3 供试药用植物内生放线菌的系统分类地位
• 6 总结与后续工作展望
• 6.1 小结
• 6.2 后续工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录