论文摘要
哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优越性。其中，二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）缺陷型的中国仓鼠卵巢上皮细胞（Chinesehamster ovary，CHO／DHFR-）表达系统应用最为广泛。 在CHO／DHFR-表达系统中，应用弱化DHFR基因（选择基因）表达水平的原理来提高肿瘤坏死因子受体Ⅱ胞外区—人免疫球蛋白IgG Fc（extracellulardomain of human tumor necrosis factor receptor-Ⅱ—IgG Fc，TNFR-Fc）融合蛋白分子的表达水平。为此，我们构建了二种可扩增双顺反子表达载体（pT-dhfr1-TRFc and pT-dhfr2-TRFc）。二种表达载体只是DHFR基因插入IRES序列之后的位置不同。 转染CHO／DHFR-细胞后，阳性克隆基因组中TNFR-Fc基因检测结果表明，重组质粒已整合到CHO基因组里。在随后通过RT-PCR方法对TNFR-Fc的mRNA转录水平检测，结果表明pT-dhfr2-TRFc组的转录水平比pT-dhfr1-TRFc组高。对阳性克隆数及阳性克隆扩大培养后的表达水平进行比较：1、pT-dhfr1-TRFc组的克隆数为416±36个，TNFR-Fc表达水平为0.7±0.15mg／L。2、pT-dhfr2-TRFc组的克隆数为102±18个，表达水平为3.8±0.8mg／L。阳性克隆数pT-dhfr1-TRFc组高，为后者的4.08倍：pT-dhfr2-TRFc组TNFR-Fc表达水平高，为前者的5.43倍。在随后的pT-dhfr2-TRFc组MTX加压条件下培养。MTX在0；20和50nM时，TNFR-Fc表达水平分别为3.8±0.8：7.2±1.1和14.4±2.3mg／L，表达水平最高提高了3.79倍。电泳分析表明：表达产物TNFR-Fc分子量约为64kd（还原条件），在非还原条件下，出现分子量约为128kd二聚体主带，还出现了64kd单体次带。活性检测实验显示，表达产物TNFR-Fc具有中和TNF活性，能抑制TNF对L929的杀伤。
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