脑室周围白质软化大鼠脑组织TLR4表达变化及与细胞凋亡的关系

论文摘要

背景脑室周围白质软化（Periventricular Leukomalacia,PVL）是早产儿最常见的脑损伤形式,也是存活早产儿出现神经发育和行为障碍的主要原因。TLR4（Toll like receptor4）是介导脂多糖（Lipopolysaccharides.LPS）最主要的受体,在免疫应答和炎症反应中起重要作用。近年来研究发现在LPS介导的早产儿PVL的发病机制中TLR4参与其中发挥了重要作用,且最新研究显示TLR4在心、肺、肝、血管等缺血再灌注引起的炎症损伤中也起到了重要作用,但在缺氧缺血导致的PVL模型中,TLR4的变化规律及作用尚属少见,有待我们进一步研究。目的选择3日龄术成熟大鼠,通过缺氧缺血性损伤制作脑室周围白质软化模型,通过测定不同时间点脑组织细胞凋亡及TLR4在（?）mRNA和蛋白水平的表达变化情况,探讨TLR4在该模型中的表达变化规律以及与细胞凋亡的关系,进一步阐明TLR4在早产儿PVL发病机理中的作用,为该病的研究提供客观的实验依据。方法140只3日龄体重5.8-10.5g新生SD大鼠,性别不限,随机分为实验组（缺氧缺血组）75只和对照组（假手术组）65只。实验组通过结扎右侧预总动脉,置放于6%氧气十94%氮气混合气体中4小时,制作早产儿脑室周围白质软化动物模型。对照组新生大鼠用同样方法分离右侧颈总动脉,但仅将手术线从颈总动脉下穿过,不予结扎,亦不予缺氧处理。在模型制备后6小时、12小时、24小时、3天、7天将动物处死,取脑组织制作石蜡切片,或将脑组织置液氮罐中待用。实验过程中实验组死亡15只,对照组死亡5只,,故进入实验的两组均为60只。观察缺氧缺血前后大鼠行为改变并测量术后不同时点体重变化；常规观察脑组织的病理变化；Tunnel法测细胞凋亡情况；采用免疫组化及RT-PCR等实验方法检测该模型中不同时间点脑组织TLR4在mRNA和蛋白水平的表达情况。SPSS17.0进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.实验组动物行为学及病理改变：缺氧缺血中大鼠主要表现为全身发绀,激惹、躁动不安,四肢强直抽动,大小便失禁,部分动物于缺氧缺血过程中死亡。缺氧缺血完成后,新生大鼠有吃奶减少,活动减少,动作不协调等异常表现。实验组新生大鼠于缺氧缺血后24h开始出现体重增长减慢,3d后开始出现体重追赶式生长,实验组缺氧缺血后24h、3d、7d体重与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。实验组各组随缺氧缺血时间的延长,病理改变越来越重,缺氧缺血6小时可见脑组织白质内胶质细胞间隙增宽；12小时胶质细胞胞体肿胀,细胞走行出现紊乱；24小时细胞间隙增宽更明显,小胶质细胞增生,星形胶质细胞肥大；3天可见脑室周围白质广泛疏松,白质结构紊乱；7天右侧脑室旁白质可呈筛网状坏死。2.细胞凋亡情况：实验组脑室周围白质及胼胝体区于缺氧缺血后6h即出现凋亡细胞百分率升高,3d达高峰,7d开始下降；对照组存在少量的凋亡细胞。实验组各时间点凋亡细胞百分率与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。3.TLR4在蛋白水平的表达状况：实验组脑室周围白质及胼胝体区于缺氧缺血后6h TLR4蛋白表达量开始增加,3d达高峰,7d开始下降；对照组各时间点TLR4蛋白的免疫阳性表达较少。实验组各时间点TLR4在蛋白水平表达与对照组相比,养异石统计学意义（P<0.05）。4. TLR4mRNA的变化：实验组脑组织于缺氧缺血后6hTLR4mRNA即开始增加,3d时达高峰,7d开始下降；对照组脑组织内可见少量的TLR4mRNA激活。实验组各时间点TLR4mRNA激活与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。5.未成熟大鼠缺氧缺血性脑室周围白质软化模型中,TLR4mRNA和蛋白水平的表达相关性分析显示二者呈正相关（r=0.675,P<0.05）。6.未成熟大鼠缺氧缺血性脑室周围白质软化模型中,TLR4mRNA和凋亡细胞百分比的相关性分析显示二者呈相关（r=0.575,P<0.05）。7.未成熟大鼠缺氧缺血性脑室周围白质软化模型中,TLR4蛋白表达量和凋亡细胞百分比的相关性分析显示二者呈正相关（r=0.774,P<0.05）结论1.新生3日龄大鼠单侧颈总动脉结扎加低氧（6%02）4h处理可以成功制作早产儿脑室周围白质软化损伤模型。2.细胞凋亡在缺氧缺血导致的PVL的发病机制中有重要作用。3.TLR4参与了缺氧缺血所致的早产儿脑室周围白质软化的发病机制。4.TLR4有可能是通过促进细胞凋亡来发挥神经细胞的损伤作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验对象
• 1.1.2 实验仪器和设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要试剂的配制
• 1.1.5 载玻片的处理
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验动物分组
• 1.2.2 模型的制备
• 1.2.3 组织标本制备
• 1.2.4 石蜡切片制备
• 1.2.5 HE染色
• 1.2.6 Tunnel法测定脑细胞凋亡
• 1.2.7 免疫组织化学染色
• 1.2.8 RT-PCR法检测TLR4在脑中的表达
• 1.3 统计分析
• 2 结果
• 2.1 行为学及体重改变
• 2.2 脑组织病理形态学改变
• 2.3 Tunnel法检测对脑组织调亡的测定
• 2.4 TLR4蛋白在脑组织中的表达变化
• 2.5 TLR4 mRNA在脑组织中的表达
• 2.6 相关性分析
• 3 讨论
• 3.1 早产儿脑室周围白质软化模型
• 3.2 PVL大鼠细胞调亡变化分
• 3.3 PVL大鼠TLR4mRNA、蛋白水平表达变化及相关性分析
• 3.4 细胞调亡与TLR4表达变化相关性分析
• 4 结论
• 参考文献
• 综述：Toll样受体4与脑室周围白质软化的研究进展
• 参考文献
• 主要中英文縮写词一览表
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢
• 个人简历