论文摘要
植物在长期进化过程中形成了一个复杂的调控体系来抵御病害胁迫的影响,包括本身保护性生理屏障以及一系列抗病相关基因的诱导表达。仅存在于植物中的WRKY转录因子基因,构成转录因子超家族,广泛参与植物抗逆反应以及多种生理代谢过程。为了探讨WRKY转录因子基因在毛竹中的作用,本研究从毛竹（Phyllostachys edulis）中克隆了一个PheWRKY1基因,对其编码蛋白的氨基酸序列及其表达特性进行了分析,并将其在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中增强表达,对所获得的转基因株系的抗病性进行了初步研究。通过RT-PCR技术,克隆得到PheWRKY1基因。序列分析表明,该基因全长1080 bp,包括一个579 bp开放阅读框,编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质,相对分子量为20.8 KDa,等电点为5.99,基因注册号为GU944762。序列分析表明,PheWRKY1基因的氨基酸序列含一个WRKY结构域和一个锌指结构C2H2,属于WRKYⅡ亚组。PheWRKY1基因编码蛋白的保守元件与禾本科植物甘蔗、水稻、小麦、黑麦草等有很高的一致性,在86%以上,与拟南芥中AtWRKY51同源性达47%。经生物信息学软件预测得知,PheWRKY1蛋白定位于细胞核内,蛋白的三级结构与禾本科植物黑麦草类似,并且该蛋白具有转录调控和信号转导等功能。对毛竹实生苗进行多种胁迫和诱导处理,提取叶片总RNA,用实时定量PCR方法分析目的基因表达模式。结果表明,外施抗病信号分子水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）均可以诱导PheWRKY1增强表达,但前者增强幅度更大,保持时间更长;紫外线B辐射也能诱导基因增强表达;外施脱落酸（ABA）和干旱胁迫,PheWRKY1表达无明显变化。野外毛竹林中感染毛竹丛枝病与枯稍病样本中PheWRKY1基因表达也有所增强。提示PheWRKY1可能通过水杨酸和茉莉酸转导途径参与病原菌诱导的信号传递,而不参与对渗透胁迫的反应。为研究PheWRKY1基因能否与顺式作用元件的W盒结合,构建了PheWRKY1基因的原核表达载体,将其转入pET-28a,并使重组质粒pET-WRKY在大肠杆菌中经IPTG诱导得到了有效的异源表达。对PheWRKY1基因构建植物过表达载体并转化模式植物拟南芥,目前已经得T2代转基因株系。转基因植株表现出不同的形态学特征,根系发达、叶片肥大、茎粗壮,提前开花且结种不良,推测PheWRKY1基因的过表达影响了转基因株系的生长发育。为进一步分析PheWRKY1基因是否调控植物抗病反应,本实验用丁香假单胞菌Pseudomonas syringae PV Tomato DC3000 （简称DC3000）侵染拟南芥,各实验材料在1d会出现小的病斑,然后病斑会向四周扩散。但随后转基因株系的病斑被局限在一个区域内,周围无明显黄化坏死组织,而野生型的病斑会一直扩散,周围黄化,直至整片叶卷曲甚至枯萎。转基因株系被侵染的整片叶以及剩余健康区域的Fv/Fm值和ΦPSⅡ值都高于野生植株。Y（NO）、Y（Ⅱ）、Y（NPQ）三个叶绿素荧光参数值的比例变化也存在差异,表现在被侵染的野生型植株的Y（NO）增长幅度高于被侵染的转基因株系,由于三者之和为1,因此导致野生型植株后两值的下降幅度也高于转基因株系。这就意味着被侵染的转基因株系整体光合性能和利用同等光强的能力优于被侵染的野生型植株。病原菌侵染下PheWRKY1基因所调控的下游抗病相关基因的表达发生了变化。荧光定量PCR结果显示,在被侵染叶片和未被侵染叶片中,转基因和野生植株的抗病相关基因PR1,PR2,PR5,NPR1表达都有所增加,但是转基因株系中这些基因表达变化更为强烈。综上所述,本研究克隆的转录因子基因的过表达提高了拟南芥转基因株系抗病能力,理论上也为改良毛竹的抗逆性提供了候选基因,同时为进一步开展其抗逆分子机制剖析和在抗逆育种中的应用研究奠定了基础。