抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究

抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究

论文摘要

猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留;疫苗制品质量问题;运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效;以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门(Shimen)株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1(+)及PBS阴性对照,第三次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平;以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1(+)和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显著(p<0.05)。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显著(P<0.05)。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组(p<0.05),含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1(+)同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1(+)对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第三次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平;以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显著(P>0.05)。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组(p<0.05)。以上结果表明,TRIF共免疫可显著增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显著提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 第一章 绪论
  • 1.1 猪瘟病毒研究进展
  • 1.1.1 猪瘟简介
  • 1.1.2 流行病学
  • 1.1.3 猪瘟病毒的分子生物学特性
  • 1.2 猪瘟诊断方法的研究进展
  • 1.2.1 血清学诊断技术
  • 1.2.2 分子生物学诊断方法
  • 1.3 猪瘟的免疫预防
  • 1.4 猪瘟疫苗的研究进展
  • 1.4.1 猪瘟病毒传统疫苗的研究
  • 1.4.2 猪瘟病毒新型疫苗的研究
  • 1.5 开展本论文研究的目的和意义
  • 第二章 DNA疫苗研究进展
  • 2.1 概述
  • 2.2 DNA疫苗作用机制
  • 2.3 增强DNA疫苗免疫效果
  • 2.3.1 免疫方式及途径的优化对DNA疫苗的增强作用
  • 2.3.2 质粒载体序列的优化对DNA疫苗的增强作用
  • 2.4 细胞因子佐剂对DNA疫苗的增强作用
  • 2.4.1 IL-2
  • 2.4.2 IL-12
  • 2.4.3 GM-CSF
  • 2.5 展望
  • 第三章 抗猪瘟病毒单基因及双基因融合DNA疫苗的初步研究
  • 3.1 材料和实验动物
  • 3.1.1 载体、病毒和细胞
  • 3.1.2 血清与二抗
  • 3.1.3 实验动物
  • 3.1.4 主要试剂
  • 3.1.5 主要溶液和培养基的配制
  • 3.1.6 主要仪器
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 猪瘟病毒基因组RNA的提取和RT-PCR
  • 3.2.2 引物的设计
  • 3.2.3 目的基因的扩增
  • 3.2.4 重组质粒DNA的构建操作
  • 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 3.2.6 质粒的转化
  • 3.2.7 质粒的小量制备
  • 3.2.8 DNA片段的回收和纯化
  • 3.2.9 细胞传代培养
  • 3.2.10 细胞冻存与复苏
  • 3.2.11 脂质体介导的真核细胞转染
  • 3.2.12 细胞接毒
  • 3.2.13 重组质粒的鉴定
  • 3.2.14 重组质粒在PK-15细胞中的瞬时表达
  • 3.2.15 间接免疫荧光检测目的蛋白表达
  • 3.2.16 Western Blot检测目的蛋白表达
  • 3.2.17 重组质粒的大量提取
  • 3.2.18 动物DNA免疫接种
  • 3.2.19 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定
  • 3.2.20 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验
  • 3.2.21 免疫小鼠IFN-γ水平的测定
  • 3.2.22 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定
  • 3.2.23 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定
  • 3.2.24 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定
  • 3.2.25 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定
  • 3.2.26 免疫猪体攻毒前后猪体组织RT-PCR检测
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 重组表达载体的构建及酶切鉴定
  • 3.3.2 目的片段的序列分析
  • 3.3.3 免疫荧光检测结果
  • 3.3.4 Western Blot检测结果
  • 3.3.5 免疫小鼠血清特异性抗体的检测
  • 3.3.6 免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖
  • 3.3.7 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌
  • 3.3.8 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定
  • 3.3.9 免疫猪体白细胞数量变化
  • rns蛋白抗体水平'>3.3.10 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或Erns蛋白抗体水平
  • 3.3.11 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状观察及体温的测定
  • 3.3.12 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定
  • 3.4 讨论
  • 第四章 TRIF对抗猪瘟DNA疫苗免疫效果的增强作用研究
  • 4.1 材料和实验动物
  • 4.1.1 载体、病毒和细胞
  • 4.1.2 血清与二抗
  • 4.1.3 实验动物
  • 4.1.4 主要试剂
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 重组质粒的大量提取
  • 4.2.2 TRIF重组质粒的鉴定
  • 4.2.3 动物分组及DNA免疫接种
  • 4.2.4 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定
  • 4.2.5 免疫小鼠IFN-γ水平的测定
  • 4.2.6 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定
  • 4.2.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定
  • 4.2.8 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定
  • 4.2.9 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定
  • 4.2.10 免疫猪体攻毒前后猪体血清和鼻拭子样品的RT-PCR检测
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 重组质粒的酶切鉴定
  • 4.3.2 免疫荧光检测结果
  • 4.3.3 pRK-TRIF对IFN-β和NF-κB启动子活性影响
  • 4.3.4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测
  • 4.3.5 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况
  • 4.3.6 免疫猪体特异性中和抗体的检测
  • 4.3.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定
  • 4.3.8 免疫猪体白细胞数量的检测
  • rns蛋白抗体的检测'>4.3.9 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或Erns蛋白抗体的检测
  • 4.3.10 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定
  • 4.4 讨论
  • 第五章 伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 病毒样品及增殖
  • 5.1.2 引物和探针序列
  • 5.2 方法
  • 5.2.1 病毒的培养
  • 5.2.2 病毒DNA提取
  • 5.2.3 临床标本的处理
  • 5.2.4 常规PCR(第一次PCR)
  • 5.2.5 标准品的制备
  • 5.2.6 荧光定量PCR
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 标准曲线的建立
  • 5.3.2 特异性检测
  • 5.3.3 重复性检测
  • 5.3.4 细胞培养法和常规PCR法检测检测PRV
  • 5.3.5 临床标本的检测
  • 5.4 讨论
  • 研究总结
  • 参考文献
  • 硕博连读期间发表与待发表的文章
  • 致谢
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