抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究

论文摘要

猪瘟（classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗（“C”株）的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留；疫苗制品质量问题；运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效；以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门（Shimen）株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂（tPA）信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1（+）及PBS阴性对照,第三次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A（ConcanavalinA, ConA）为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1（+）和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显著（p<0.05）。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显著（P<0.05）。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组（p<0.05）,含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1（+）同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1（+）对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第三次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A（ConcanavalinA, ConA）为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显著（P>0.05）。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组（p<0.05）。以上结果表明,TRIF共免疫可显著增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显著提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。

论文目录

中文摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 猪瘟病毒研究进展

1.1.1 猪瘟简介

1.1.2 流行病学

1.1.3 猪瘟病毒的分子生物学特性

1.2 猪瘟诊断方法的研究进展

1.2.1 血清学诊断技术

1.2.2 分子生物学诊断方法

1.3 猪瘟的免疫预防

1.4 猪瘟疫苗的研究进展

1.4.1 猪瘟病毒传统疫苗的研究

1.4.2 猪瘟病毒新型疫苗的研究

1.5 开展本论文研究的目的和意义

第二章 DNA疫苗研究进展

2.1 概述

2.2 DNA疫苗作用机制

2.3 增强DNA疫苗免疫效果

2.3.1 免疫方式及途径的优化对DNA疫苗的增强作用

2.3.2 质粒载体序列的优化对DNA疫苗的增强作用

2.4 细胞因子佐剂对DNA疫苗的增强作用

2.4.1 IL-2

2.4.2 IL-12

2.4.3 GM-CSF

2.5 展望

第三章抗猪瘟病毒单基因及双基因融合DNA疫苗的初步研究

3.1 材料和实验动物

3.1.1 载体、病毒和细胞

3.1.2 血清与二抗

3.1.3 实验动物

3.1.4 主要试剂

3.1.5 主要溶液和培养基的配制

3.1.6 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 猪瘟病毒基因组RNA的提取和RT-PCR

3.2.2 引物的设计

3.2.3 目的基因的扩增

3.2.4 重组质粒DNA的构建操作

3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.6 质粒的转化

3.2.7 质粒的小量制备

3.2.8 DNA片段的回收和纯化

3.2.9 细胞传代培养

3.2.10 细胞冻存与复苏

3.2.11 脂质体介导的真核细胞转染

3.2.12 细胞接毒

3.2.13 重组质粒的鉴定

3.2.14 重组质粒在PK-15细胞中的瞬时表达

3.2.15 间接免疫荧光检测目的蛋白表达

3.2.16 Western Blot检测目的蛋白表达

3.2.17 重组质粒的大量提取

3.2.18 动物DNA免疫接种

3.2.19 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定

3.2.20 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验

3.2.21 免疫小鼠IFN-γ水平的测定

3.2.22 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定

3.2.23 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定

3.2.24 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定

3.2.25 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定

3.2.26 免疫猪体攻毒前后猪体组织RT-PCR检测

3.3 结果

3.3.1 重组表达载体的构建及酶切鉴定

3.3.2 目的片段的序列分析

3.3.3 免疫荧光检测结果

3.3.4 Western Blot检测结果

3.3.5 免疫小鼠血清特异性抗体的检测

3.3.6 免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖

3.3.7 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌

3.3.8 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定

3.3.9 免疫猪体白细胞数量变化

rns蛋白抗体水平'>3.3.10 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或E^rns蛋白抗体水平

3.3.11 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状观察及体温的测定

3.3.12 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定

3.4 讨论

第四章 TRIF对抗猪瘟DNA疫苗免疫效果的增强作用研究

4.1 材料和实验动物

4.1.1 载体、病毒和细胞

4.1.2 血清与二抗

4.1.3 实验动物

4.1.4 主要试剂

4.2 方法

4.2.1 重组质粒的大量提取

4.2.2 TRIF重组质粒的鉴定

4.2.3 动物分组及DNA免疫接种

4.2.4 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定

4.2.5 免疫小鼠IFN-γ水平的测定

4.2.6 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定

4.2.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定

4.2.8 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定

4.2.9 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定

4.2.10 免疫猪体攻毒前后猪体血清和鼻拭子样品的RT-PCR检测

4.3 结果

4.3.1 重组质粒的酶切鉴定

4.3.2 免疫荧光检测结果

4.3.3 pRK-TRIF对IFN-β和NF-κB启动子活性影响

4.3.4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测

4.3.5 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况

4.3.6 免疫猪体特异性中和抗体的检测

4.3.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定

4.3.8 免疫猪体白细胞数量的检测

rns蛋白抗体的检测'>4.3.9 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或E^rns蛋白抗体的检测

4.3.10 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定

4.4 讨论

第五章伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

5.1 材料

5.1.1 病毒样品及增殖

5.1.2 引物和探针序列

5.2 方法

5.2.1 病毒的培养

5.2.2 病毒DNA提取

5.2.3 临床标本的处理

5.2.4 常规PCR（第一次PCR）

5.2.5 标准品的制备

5.2.6 荧光定量PCR

5.3 结果

5.3.1 标准曲线的建立

5.3.2 特异性检测

5.3.3 重复性检测

5.3.4 细胞培养法和常规PCR法检测检测PRV

5.3.5 临床标本的检测

5.4 讨论

研究总结

参考文献

硕博连读期间发表与待发表的文章

致谢

抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢