Toll样受体4信号通路对骨髓间充质干细胞增殖和凋亡调控作用的实验研究

论文摘要

目的：研究Toll样受体4（Toll-like receptor-4, TLR4）信号转导通路对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）增殖和氧化应激环境下凋亡的调控作用并探讨其潜在机制。方法：分别从C57BL/10J（wild-type）、C57BL/10ScNJ（TLR4lps-del）、C57BL/6J （wild-type）、MyD88-/-小鼠获取全骨髓细胞进行体外培养和传代,分离和纯化MSCs,研究其特性与TLR4的表达。以5-氮胞苷（5-Aza,10μmol/L）与MSCs共孵育,研究MSCs向心肌细胞的分化能力。以TLR4的配体—细菌脂多糖（LPS）激活TLR4信号通路,采用CCK-8（Cell Counting Kit）法检测MSCs增殖；以H2O2（100μmol/L）和无血清培养模拟氧化应激环境,采用流式细胞术和细胞核染色荧光显微镜检测MSCs的凋亡；取LPS刺激后的培养细胞上清液,采用ELISA法检测白细胞介素（IL）-6水平；以Western blot法检测LPS刺激MSCs后NF-κB （nuclear factor kappa B,核因子-κB）p65和Akt磷酸化水平的变化。给予不同浓度辛伐他汀预处理联合一定浓度LPS观察对MSCs增殖和凋亡的影响。结果：1,从全骨髓细胞中获取的、贴壁生长的成纤维样细胞具有MSCs的表型特征,经多次传代后仍保持其特性。在体外,MSCs经5-氮胞苷诱导后可表达心肌特异性蛋白；2,MSCs在mRNA和蛋白水平均表达功能性TLR4；3,低浓度LPS （0.1,1.0μg/ml）可显著促进MSCs增殖；4,H2O2和去血清培养可诱导MSCs凋亡；低浓度LPS可减少H2O2/去血清培养所致的MSCs凋亡。而高浓度LPS（10.0μg/ml）不能促进MSCs增殖,也不减少MSCs凋亡；5,在TLR4lps-del和MyD88-/-组,低浓度LPS对MSCs无保护作用；6,低浓度LPS（0.1,1.0μg/ml）可提高MSCs的NF-κB p65（Ser 536）磷酸化和Akt（Ser 473）磷酸化水平,但不能促进TLR4lps-del MSCs的NF-κB p65（Ser 536）和Akt （Ser473）磷酸化；7,低剂量辛伐他汀预处理联合适当剂量LPS可进一步促进MSCs增殖,但不能显著减少H202和去血清培养所致的MSCs凋亡。结论：1,通过对贴壁细胞的反复传代培养可从骨髓中分离和纯化MSCs; 2, MSCs具有分化为心肌细胞的潜能；3,骨髓MSCs表达功能性Toll样受体-4（TLR-4）；4,低浓度LPS可通过TLR4/MyD88信号途径促进MSCs增殖、减少氧化应激所导致的MSCs凋亡,而高浓度LPS不利于MSCs增殖和存活；4,TLR4对MSCs的保护机制与提高MSCs的NF-κB p65（Ser 536）和Akt （Ser 473）磷酸化水平有关；5,小剂量辛伐他汀联合适当浓度LPS有利于MSCs的存活。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定 和向心肌细胞的诱导分化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Tou样受体4信号通路对骨髓 间充质干细胞增殖和凋亡的调控作用
• 第1节 骨髓间充质干细胞Toll样受体4的表达
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 第2节 Tull样受体4信号通路 对骨髓间充质干细胞增殖的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第3节 Ton样受体4对氧化应激环境下 骨髓间充质干细胞凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Toll样受体4信号通路调控骨髓间充质 干细胞生物学行为的机制探讨
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 辛伐他汀预处理联合脂多糖对骨髓 间充质干细胞增殖和凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢