利用拟南芥筛选甜瓜枯萎病病原激发子的初步研究

论文摘要

甜瓜是新疆的重要经济作物。枯萎病病害给甜瓜生产造成巨大损失。目前国内外学者对于甜瓜抗枯萎病分子机理的研究主要集中于分离和克隆甜瓜抗枯萎病基因,对于甜瓜与枯萎病菌互作的细胞信号转导机制的研究未见报导。由于甜瓜基因组大,遗传背景复杂,生长周期长,难于进行遗传操作,从分子水平深入、全面研究甜瓜对于枯萎病菌的抗、感性机理仍然具有难以逾越的障碍。拟南芥作为植物分子生物学研究的模式植物,其基因组小、生长周期短、便于遗传操作的特点已为深入研究植物与微生物互作的抗病分子机制带来许多重大突破。本文利用拟南芥和甜瓜枯萎病菌建立研究系统,通过构建抗病标记基因（病程相关蛋白）启动子与GUS融合基因表达载体并转化拟南芥获得转基因植株,进一步利用转基因植株初步筛选病原激发子,以期为从分子水平探讨植物与枯萎病菌互作的细胞信号转导机制提供依据,为从根本上解决甜瓜枯萎病害奠定基础。本实验将甜瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌培养液分离成不同的组分,分别对甜瓜和拟南芥幼苗、种子进行了处理,建立起了尖孢镰刀菌与甜瓜和拟南芥的互作的研究系统。从野生型拟南芥中克隆获得了病程相关蛋白基因启动子,构建了该启动子驱动的GUS报告基因载体并转化拟南芥,获得了阳性转化植株,进一步利用转基因植株初步筛选获得枯萎菌培养液中具有激发子活性的组分。主要研究结果如下:1.从野生型拟南芥基因组中通过PCR扩增获得病程相关蛋白（PR-1）基因启动子。对PR-1启动子进行序列测定,启动子全长910bp,包含启动子共有的高度保守序列TATA框和核心序列CAAT。将该基因构建到植物表达载体pBI121上,获得PR-1基因启动子驱动GUS报告基因的融合载体pBI-pr1p。2.将表达载体转化农杆菌感受态细胞,通过农杆菌花序浸染法将融合基因转入野生型拟南芥,经卡那筛选获得T1代转基因植株,PCR扩增结果表明病程相关蛋白启动子与GUS的融合基因已整合到拟南芥植株中,GUS检测结果表明其基因组中获得表达,由此建立了枯萎病菌激发子的筛选系统。3.将甜瓜枯萎病培养液初步分离的成六个组分,利用转基因拟南芥对各个组分进行激发子活性检测。尖孢镰刀菌菌丝体冻干研磨成粉的水溶液和粗毒素处理转基因拟南芥后,GUS染色检测为阳性。说明这两种组分均可诱导PR-1基因启动表达,初步推测其具有激发子活性。此外,菌丝体经高温处理丧失激发子活性,推测菌丝体中的激发子物质可能不耐热,而粗毒素经高温处理后仍具有激发子活性,推测其可能为耐热组分。4.枯萎病菌外泌组分——粗毒素可完全抑制拟南芥种子萌发,并使甜瓜和拟南芥幼苗萎蔫;经高温处理后,粗毒素对拟南芥种子萌发的抑制作用有所下降,说明其丧失了部分活性。推测粗毒素活性成分中既有耐热组分,又有不耐热组分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 植物与病原菌互作分子机制的研究进展
• 1.1 植物与病原菌相互作用的遗传学基础
• 1.2 激发子
• 1.3 植物的激发子受体
• 1.4 激发子受体在植物与病原菌互作过程中的作用
• 2 病程相关蛋白
• 2.1 PR蛋白
• 2.2 基因启动子的介绍
• 3 枯萎病研究进展
• 3.1 病原菌的形态、生理研究概况
• 3.2 致病机制
• 3.3 病菌外泌物的毒性
• 4 本研究的目的和意义
• 第一章 拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 拟南芥基因组DNA的提取
• 1.2.2 PCR扩增910kb拟南芥病程相关蛋白启动子基因序列
• 1.2.3 PCR反应产物的回收
• 1.2.4 目的基因的亚克隆
• 1.2.5 重组子的筛选
• 1.2.6 序列测定及分析
• 1.2.7 植物表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 拟南芥基因组DNA提取
• 2.2 910bp病程相关蛋白PR-1基因启动子PCR扩增
• 2.3 重组子的双酶切鉴定和PCR鉴定
• 2.4 序列测定
• 2.5 质粒pBI-pr1p的双酶切鉴定
• 3 讨论
• 第二章 拟南芥的转化及分子生物学检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 1.2.2 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 1.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.4 转化根癌农杆菌
• 1.2.5 阳性克隆的筛选与鉴定
• 1.2.6 拟南芥的转化
• 1.2.7 阳性转化植株的筛选
• 1.2.8 阳性转化植株的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 转化植株的获得
• 2.2 阳性植株的鉴定
• 3 讨论
• 第三章 利用转基因拟南芥筛选甜瓜枯萎病粗激发子
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 植物材料的培养
• 1.2.2 甜瓜尖孢镰刀菌的培养及其形态观察
• 1.2.3 甜瓜枯萎病菌各组分的分离
• 1.2.4 甜瓜尖孢镰刀菌的致萎活性的检测
• 1.2.5 甜瓜枯萎病病原激发子的筛选
• 1.2.6 甜瓜尖孢镰刀菌毒素活性的检验
• 2 结果与分析
• 2.1 甜瓜尖孢镰刀菌的培养性状及其形态观察
• 2.2 甜瓜尖孢镰刀菌致萎活性的检测
• 2.3 甜瓜枯萎病激发子的筛选结果
• 2.4 甜瓜尖孢镰刀菌毒素活性的检验
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 主要英文缩略词表
• 硕士研究生期间发表论文
• 附录A
• 附录B:
• 致谢