论文摘要
本研究以新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因和鸡贫血病毒（CAV）凋亡素（Apoptin）基因为效应基因,以真核表达质粒pSFV为载体,分别构建了含HN和Apoptin基因的重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin。利用以鸡痘病毒为载体的重组鸡痘病毒vFVHN、vFVApoptin及上述重组真核表达质粒对其进行了体内外抑瘤实验研究和抑瘤机制的初步探索,为上述两种基因在肿瘤生物治疗中的应用奠定实验和理论基础。本研究以真核表达质粒pSFV为载体,分别构建了能够有效表达NDVHN和CAV Apoptin的重组真核表达质粒pSFVHN和pSFVApoptin。通过电穿孔法将pSFVHN和pSFVApoptin转染入人宫颈癌Hela细胞通过RT-PCR、western-blot法及间接免疫荧光检测了重组体中外源基因在Hela细胞内表达,结果表明外源基因Apoptin和HN在Hela细胞中获得了有效转录和正确表达;采用MTT法分别检测了pSFVHN和pSFVApoptin对Hela肿瘤细胞的体外杀伤作用,结果表明,上述重组体对Hela细胞具有明显的杀伤作用;通过吖锭橙/溴化乙锭染色、DAPI染色、流式细胞仪结合DCFA染色、罗丹明123染色分别探讨了两种重组体对Hela肿瘤细胞的抑制机制,结果表明,pSFVHN和pSFVApoptin可诱导Hela肿瘤细胞凋亡,并可上调细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位,由此推测其所诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体途径发生的;通过流式细胞仪结合MHC-Ⅰ分子表达检测等方法检测了两种重组体对细胞免疫功能的影响,结果表明,pSFVHN和pSFVApoptin可不同程度的上调肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达,提高肿瘤细胞的免疫原性。本研究利用重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin感染体外培养的人宫颈癌Hela细胞,运用Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光等方法检测外源基因的表达,实验结果显示,重组鸡痘病毒所携带的外源基因可在Hela细胞中有效转录和正确表达。采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、DAPI染色、流式细胞仪检测细胞内活性氧水平、线粒体膜电位及MHC-Ⅰ分子的表达等方法观察重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin对Hela肿瘤细胞的体外杀伤作用及其对肿瘤细胞免疫原性的影响,实验结果显示,上述重组病毒可有效抑制Hela细胞的生长,并可推测其可通过线粒体途径诱导人宫颈癌Hela细胞发生凋亡。另外,其次本研究还复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,利用瘤内注射的方法,通过抑瘤率检测和生存期检测等方法探讨了重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin和重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin的体内抑瘤作用。结果显示,上述重组体可有效抑制荷瘤动物模型肿瘤组织的生长,并在一定程度上延长动物模型生存期。本研究还通过小鼠脾CD4+、CD8+T细胞亚群的数量、脾细胞特异性CTL杀伤活性等检测,探讨了上述重组体对荷瘤动物模型免疫功能的影响,结果显示,上述重组体可在不同程度内提高荷瘤动物模型CD4+、CD8+T细胞亚群的数量,并诱导产生抗肿瘤特异性CTL杀伤活性。本研究通过对重组真核表达质粒pSFVHN、pSFVApoptin和重组鸡痘病毒vFVHN和vFVApoptin的体内外抑瘤作用研究,说明了其对体外培养的人宫颈癌Hela细胞和C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型的抑制作用。提示,NDV HN和CAV Apoptin可作为效应基因应用于肿瘤生物治疗领域,但对其确切机制尚需进一步研究。