论文摘要
目的在前期实验“内皮抑素和E/V比值在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用”的研究基础上,进一步探讨大鼠脑缺血再灌注损伤后TGF-β1（transforminggrowth factor-β1）及其Ⅰ型受体—ALK1（activin receptor-like kinase 1）、ALK5（activin receptor-like kinase 5）的表达变化和血管密度的变化及它们之间的相关性。方法采用线栓法制造脑缺血动物模型。将56只雄性成年wistar大鼠随机分为2组:假手术组（n=8）、模型组（n=48）。其中模型组根据再灌注的时间分为6小时,1天,2天,3天,4天和7天6个组,每组8只。采用改良的Zea Longa线栓法,建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞（MCAO）缺血再灌注模型。参照Zea Longa 5分制评分标准评分,假手术组组大鼠手术后1天、模型组大鼠再灌注达到相应的观察时间点时,将大鼠处死后断头取脑,取梗死灶脑组织:1)TTC染色。2)HE染色观察脑组织病理学变化。3)免疫组化法分别检测CD105、TGF-β1及其Ⅰ型受体的蛋白分布。4)CD105阳性细胞用来计数微血管密度。5)实时定量PCR法检测mRNA水平的变化。6)分析ALK1和ALK5与血管密度的相关性。结果1)病理改变与假手术组相比,大鼠脑缺血90min再灌注后病理改变较明显。再灌注6h缺血侧锥体细胞轻度肿胀,胞浆水肿,胞浆淡染,少数出现核深染。部分神经元体积有所缩小呈三角形或长条形,与周围组织脱离,胞浆空泡状。再灌注1d,神经元体积明显缩小,胞核固缩深染,尼氏小体减少或消失,间质水肿明显,神经纤维走行不清,海马区神经细胞层次明显减少。再灌注2d,缺血中心组织疏松,形似海绵,点状坏死灶形成,神经纤维走行消失,可见白细胞浸润,偶见胶质细胞增生。再灌注3d,锥体细胞大量缺失、变性、坏死,出现大片坏死灶,胶质细胞增生,齿状回颗粒细胞变性呈空泡样。再灌注4d到7d缺血灶周围大量胶质胶质细胞增生,聚集成堆。2)蛋白的定性表达CD105阳性细胞定位于所有血管内皮细胞,但主要位于毛细血管。免疫组化染色显示在假手术组可见少量的低表达的TGF—β1免疫阳性细胞;缺血再灌注后,TGF—β1蛋白在缺血周围区的神经元、胶质细胞中表达增多。ALK1在假手术组中即有明显表达,主要在神经元、胶质细胞和血管内皮细胞表达。再灌注后,表达强度有所减弱。假手术组中,ALK5在个别细胞中呈弱阳性表达;缺血再灌注后,ALK5除在神经元和胶质细胞表达增多外,少数内皮细胞亦有表达。3)血管密度的改变假手术组的血管密度为34.23±1.45。再灌注6h后,微血管密度较假手术组有所升高,再灌注1d继续升高到44.10±18.30,但与假手术组相比其差异无统计学意义。再灌注2d时,微血管密度结果出现下降的趋势,3d时降至15.50±5.72（P＜0.05）。再灌注4d时,微血管密度有所回升,到7天时升至38.85±11.55,与假手术组相比,其差异无统计学意义。4)mRNA水平的变化以假手术组为参照,其各个指标的mRNA的表达量均定为1。缺血再灌注后各时间点,TGF—β1mRNA水平较假手术组明显升高,差异均有统计学意义。再灌注后6h至1d,其水平逐渐升高（P＜0.01）,2d时有所回落（P＜0.05vs假手术组）,再灌注3d至7d,又出现升高的趋势,7d时升至最高,其表达水平约为假手术组的5倍（P＜0.01）。ALK1mRNA缺血再灌注后持续低表达,与假手术组相比,2d时降至最低,其表达水平仅为假手术组的44%（P＜0.01）,再灌注后3d时有所回升（P＜0.05）,4d时进一步回升,但仍低于假手术组,再灌注7d时再次下调至假手术组水平的46%（P＜0.01）。ALK5mRNA再灌注早期无明显变化,1d时开始上升,2d和3d时继续上升,但无统计学意义,4d达峰值,其表达约为假手术组的4倍（P＜0.01）,再灌注7d时有所回落,但与假手组相比,仍有显著性差异（P＜0.01）。5)ALK1mRNA的表达变化与血管密度的变化呈正相关（r=0.370,P＜0.05）;而ALK5mRNA的表达变化与血管密度的变化无相关性（P=-0.182）。结论缺血再灌注后,TGF—β1主要在缺血周围区的神经元、胶质细胞中表达;ALK1主要在神经元、胶质细胞和血管内皮细胞表达;ALK5主要在神经元和胶质细胞表达,少数内皮细胞亦有表达。缺血再灌注后,微血管密度先升后降,第三天达最低;TGF—β1mRNA和ALK5mRNA再灌注后总体上呈持续高表达趋势,前者7天时达最高,但2天时有一反降过程,而后者4天时即达高峰;ALK1mRNA于再灌注后呈显著低表达,以2天、3天时最低,其变化与血管密度的变化呈正相关。未缺血时以ALK1受体的表达为主,缺血再灌注后ALK5受体的表达变得活跃;TGF-β1、ALK1和ALK5并不局限在一种细胞中表达,推测不同的细胞间可能相互作用,传导TGF-β1信号。
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