牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用

论文摘要

牛呼吸系统综合征Bovine respiratory disease complex（BRDC）是引起世界范围内的舍饲牛发病和死亡的主要原因,给养牛业带来了严重的经济损失,牛副流感病毒3型（BPIV-3）是BRDC的主要病原之一,本研究旨在从具有BRDC的患牛体内分离BPIV-3;应用基因工程方法获得BPIV-3的HN蛋白抗原,建立间接ELISA检测方法,分别用病毒中和试验和间接ELISA方法监测病牛抗体变化,通过比较确定最佳的中和抗体的检测方法,为下一步疫苗的开发提供有效的抗体检测手段。将采集的病牛鼻汁和牛乳经处理后分别接种到MDBK细胞进行病毒的分离,当产生稳定的细胞病变（CPE）以后进行CPE和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及RT-PCR方法鉴定分离的病毒；应用DNAstar软件在HN蛋白的抗原表位区设计一对表达引物,应用RT-PCR方法扩增HN基因,经pMD18-T过度以后再将HN基因连接到PQE30表达载体,把重组载体PQE30-HN经IPTG诱导后在大肠杆菌XL 1 blue中表达,用SDS-PAGE和Western-blotting鉴定重组蛋白；应用电洗脱方法纯化重组HN蛋白,经抗原浓度、包被抗原时间、封闭液的种类和封闭时间等条件的优化,以及特异性、敏感性和重复性试验等建立间接ELISA方法；最后应用建立的间接ELISA方法和病毒中和试验跟踪监测5头典型发病牛中和抗体13个月,并将检测结果与病毒中和试验监测结果进行比较分析,同时应用该ELISA方法对4个农场的523份牛血清进行抗体检测,初步了解黑龙江垦区牛副流感病毒3型的感染情况。从病料中分离到一种RNA病毒,能够与参考毒株BPIV-3抗血清发生病毒中和反应,与BPIV-3的HN基因同源性高达99.8%。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示,康复期抗体效价是急性期的4倍以上。本实验成功构建了表达载体pQE30-HN,而且在大肠杆菌XL1blue中成功诱导表达得到约40kDa的重组蛋白,经Western-blotting试验表明重组HN能够与BPIV-3阳性血清反应,证明该蛋白具有良好的抗原性。得到间接ELISA方法最优的抗原包被浓度（6μg/ml）、血清稀释度（1：50）、封闭液（5%脱脂奶粉）、封闭时间（37℃60min）,二抗浓度（1：10000）、临界值（OD450 0.297）。特异性试验显示与BPIV-3阳性血清反应呈阳性,而与牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒阳性血清检测结果为阴性,敏感性试验结果表明比病毒中和试验检测的抗体效价高2-4个滴度,感染牛抗体检测结果表明感染牛的中和抗体效价发病初的6-8个月内能够维持在1：32～1：128,然后开始下降,最后维持在1：8～1：16之间。间接ELISA检测的抗体变化趋势与病毒中和试验相似,但间接ELISA检测的抗体滴度比病毒中和试验高2-4个滴度,同时应用建立的的ELISA检测方法监测的523份牛血清结果为,新华农场（24／52）；绿色草原农场（24／87）；855农场（101／131）；291农场（38／53）阳性率和抗体阳性率分别为46.15%、77.10%、77.70%。本实验成功分离了BPIV-3,证实BPIV-3也是我国BRDC的病原之一；成功获得了重组HN蛋白,并建立了特异性强敏感性较高的间接ELISA检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 牛呼吸系统综合症研究进展
• 1.2 BPIV-3临床特征
• 1.3 BPIV-3研究进展
• 1.4 BPIV-3致病机理
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 BPIV-3的分离与鉴定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 BPIV-3 HJ-1株HN基因全序列分析及原核表达
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 BPIV-3间接ELISA诊断方法的建立及应用
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历