恶臭假单胞菌KTQQ20 PHA产量的提高和聚3-羟基癸酸3-羟基十一烯酸的合成及其表征

论文摘要

恶臭假单胞菌KTQQ20是KT2442的脂肪酸β氧化弱化菌株,它能合成高含量长链单体的PHA甚至是长链单体的均聚物,但细胞干重（CDW）和PHA含量都很低。为了提高细胞干重和PHA含量,一方面,我们向培养基中添加了葡萄糖;另一方面我们在KTQQ20的基础上,分别敲除了3-酮酰CoA硫解酶同工酶的基因pp3280和pp4636,得到了两个突变株KTQQ21和KTQQ22。结果发现,在添加了葡萄糖后,KTQQ20的CDW和PHA含量都显著增加,而PHA中3-羟基癸酸（3HD）和3-羟基十二酸（3HDD）的摩尔比例并没有发生变化,这表明葡萄糖能提高CDW和PHA含量。同样是添加了葡萄糖,敲除了pp4636的KTQQ22与KTQQ20相比,虽然CDW并没有显著变化,但PHA含量却显著增加,高达86.57wt%,这暗示着pp4636基因的缺失,使β氧化在该处进一步受阻,使得更多的PHA合成前体流向PHA合成途径。我们以十一烯酸（10-undecenoic aicd,10-UD）和葡萄糖为碳源,利用P. putida KTQQ22,尝试合成聚3-羟基十一烯酸（poly（3-hydroxy-undecenoate）,PHUe）的均聚物,但根据GC和GC-MS的结果,我们发现单体中含有3-羟基-癸酸（3HD）和3-羟基-十一烯酸（3HUe）。根据实验的数据,我们证实单体3HD来源于底物葡萄糖,而3HUe来源于底物10-UD。由于KTQQ22中由PhaG介导的将R-3-羟基酰基ACP转化成R-3-羟基酰基CoA的途径被阻断,因此我们推测在KTQQ22中还存在这样的PHA合成途径:葡萄糖降解的中间产物进入脂肪酸从头合成途径,新合成的脂肪酸进入脂肪酸β氧化途径,生成的3-羟基脂肪酸再进入PHA中。我们发现,当碳源10-UD和葡萄糖同时存在时,该途径对PHA合成的直接贡献很小。当10-UD和葡萄糖的浓度分别为4.5 g/L和15 g/L时,KTQQ22所合成的聚（3-羟基癸酸3-羟基十一烯酸）（PHDHUe）中3HD和3HUe分别为4.45mol%和9.55mol%,在材料物理性能的测试中,我们发现PHDHUe的玻璃化转变温度（Tg）约为-53℃,明显低于其它的mcl PHA。另外,PHDHUe在52℃还可以看到明显的熔融峰,熔融焓为19 J/g,与其它的mcl PHA接近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英语缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的简介.
• 1.2 PHA 的合成途径
• 1.2.1 scl PHA 合成途径
• 1.2.2 mcl PHA 合成途径
• 1.3 PHA 颗粒的结构
• 1.4 PHA 颗粒的形成模型
• 1.5 PHA 合成的调节
• 1.6 Pseudomonas 中mcl PHA 的合成
• 1.6.1 P. oleovorans 的PHA 合成
• 1.6.2 P. putida 的PHA 合成
• 1.7 不饱和脂肪酸的合成和修饰
• 1.8 PHA 的理化性质
• 1.9 论文工作的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要原料、试剂与仪器
• 2.1.1 主要原料与化学试剂
• 2.1.2 主要分子生物学试剂与试剂盒
• 2.1.3 主要的实验仪器设备
• 2.2 培养基、菌种与质粒
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 菌种与质粒
• 2.3 P.putida KTQQ20 的基因敲除.
• 2.3.1 大肠杆菌S17-1 感受态细胞的制备
• 2.3.2 自杀质粒pKQQ07 或pKQQ10 转化大肠杆菌S17-1 感受态细胞
• 2.3.3 利用接合转化法将目标质粒导入恶臭假单胞菌P.putida 中
• 2.3.4 菌落PCR（colony PCR）
• 2.4 P.putida 的发酵
• 2.4.1 培养基及碳源的配制
• 2.4.2 P.putida 的摇瓶发酵培养
• 2.4.3 发酵后处理
• 2.5 PHA 的提取纯化以及成膜
• 2.5.1 PHA 的分离提取
• 2.5.2 PHA 的成膜
• 2.6 理化分析
• 2.6.1 GC 分析干菌体中单体组分和PHA 的含量.
• 2.6.2 GC-MS 分析PHA 材料的单体组分
• 2.6.3 FT-IR 检测PHA 材料中含双键的单体.
• 2.6.4 NMR 鉴定PHA 的化学结构
• 2.6.5 胶渗透色谱法（GPC）测定PHA 分子量
• 2.6.6 示差扫描量热法（DSC）分析PHA 的热性质.
• 2.6.7 热失重分析仪（TGA）测定PHA 的热稳定性
• 2.6.8 万能材料拉力实验机测定材料的机械性能
• 第三章 P. putida KTQQ20 PHA 产量的提高
• 3.1 P. putida KTQQ20 基因敲除
• 3.2 葡萄糖对KTQQ20 等突变株合成PHA 的影响
• 3.3 pp3280 和pp4636 基因对KTQQ20 等突变株PHA 合成的影响
• 第四章 聚3-羟基癸酸3-羟基十一烯酸的合成和表征
• 4.1 GC 和GC-MS 鉴定材料的单体组成
• 4.2 FT-IR 鉴定材料中不饱和基团
• 1H NMR 和¹³C NMR 鉴定材料的结构'>4.3¹H NMR 和¹³C NMR 鉴定材料的结构
• 4.4 葡萄糖浓度对材料合成的影响
• 4.5 材料的物理性能
• 第五章 结论
• 第六章 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历及发表论文