抗MRSA海绵共生放线菌的分离及菌株HA01041、HA01184的分类鉴定、发酵优化

论文摘要

本论文从海南、湛江等海域采集海绵样品,进行海绵共生放线菌的分离,对所分离的放线菌进行抗MRSA活性菌株的筛选,并对活性较强的菌株HA01041、HA01184进行分类鉴定、发酵优化等方面的研究,主要研究结果如下:采用7种培养基对采集自湛江特呈岛的海绵样品进行放线菌分离。结果表明,以海水高氏一号培养基为分离培养基时,能够获得数量、种类最多的放线菌,且细菌、真菌数量少,最适于海绵共生放线菌的分离。以海水高氏一号为分离培养基,采用平板稀释法,从海南、湛江沿海采集的39份样品中共分离获得放线菌583株。以MRSA3558菌株为指示菌,通过纸片扩散法筛选得到77株活性菌。其中菌株HA01041、HA01184活性较强且遗传稳定,选择这两个菌株作为目标菌株进行下一步研究。结合菌株HA01041、HA01184的形态特征、培养特征、生理生化特征、16S rDNA及其系统发育分析,初步鉴定菌株HA01041为春季链霉菌Streptomyces verne;菌株HA01184属于链霉菌属,可能是来自海洋的一个新种,命名为Streptomyces sp. HA01184,有待于DNA-DNA杂交进一步鉴定。研究明确了菌株HA01041、HA01184的最佳发酵条件和培养基组成。确定菌株HA01041最佳培养基组成及发酵条件为:蔗糖1.0%,甘油2.0%,硫酸铵1.0%,大豆玉米粉1.5%,K2HPO40.05%,天然陈海水75%,蒸馏水25%,初始pH7.07.2,种龄48h,接种量10%,摇床转速为200r/min,培养温度28℃,250mL三角瓶装液量75mL,发酵培养5d。确定菌株HA01184最佳培养基组成及发酵条件为:可溶性淀粉1.5%,葡萄糖1.5%,硫酸铵1.0%,大豆玉米粉1.5%,K2HPO40.05%,天然陈海水75%,蒸馏水25%,初始pH7.07.2,种龄60h,接种量12%,摇床转速为200r/min,培养温度28℃,250mL三角瓶装液量75mL,发酵培养5d。通过发酵优化,菌株HA01041、HA01184的抑菌圈直径分别由16.0mm、18.0mm增大为26.0mm、27.5mm。对菌株HA01041、HA01184所产抗菌活性物质理化性质进行了初步探讨,研究表明菌株HA01041、HA01184所产的抗菌活性物质均具有较强的光稳定性和热稳定性,当发酵液pH3.09.0时,抑菌活性变化不大。菌株HA01041、HA01184所产的活性物质均易溶于氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇及丙酮,微溶于水,不溶于苯、石油醚和环己烷。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 MRSA 的概念及特点
• 1.2 海洋放线菌及其产生的活性物质
• 1.2.1 海洋放线菌的分布
• 1.2.2 海洋放线菌产生的活性物质
• 1.3 海绵及其共生微生物
• 1.3.1 海绵生物学简介
• 1.3.2 海绵共生微生物
• 1.3.3 海绵共生微生物的多样性
• 1.3.4 海绵共生微生物产生的活性物质
• 1.3.5 海绵共生微生物的研究前景
• 1.4 本论文研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要溶液
• 2.2 主要仪器
• 2.3 供试菌株
• 2.4 培养基
• 2.4.1 放线菌分离培养基
• 2.4.2 放线菌分类鉴定培养基（形态特征和培养特征）
• 2.4.3 放线菌分类鉴定培养基（生理生化特征）
• 2.4.4 发酵优化培养基
• 2.4.5 其他培养基
• 2.5 海绵共生放线菌的分离及其抗MRSA 菌株的筛选
• 2.5.1 海绵样品的采集与处理
• 2.5.2 海绵共生放线菌的分离
• 2.6 海绵共生放线菌抗MRSA 活性菌株的筛选
• 2.6.1 指示菌菌悬液的制备
• 2.6.2 海绵共生放线菌发酵液的制备
• 2.6.3 抗MRSA 活性菌株的初筛
• 2.6.4 活性菌株的复筛
• 2.6.5 活性菌株保藏
• 2.7 放线菌的分类鉴定
• 2.7.1 形态学特征和培养特征
• 2.7.2 生理生化特征
• 2.7.3 抗MRSA 活性菌株16S rDNA 序列分析及其系统发育分析
• 2.8 活性菌株HA01041 和HA01184 的发酵优化
• 2.8.1 培养条件
• 2.8.2 测定方法
• 2.8.3 发酵培养基优化
• 2.8.4 培养条件对菌株HA01041、HA01184 活性的影响
• 2.9 活性物质的部分理化性质研究
• 2.9.1 活性物质的稳定性
• 2.9.2 活性物质的萃取和溶解性试验
• 3 结果与分析
• 3.1 抗MRSA 海绵共生放线菌的分离
• 3.1.1 海绵共生放线菌分离培养基的选择
• 3.1.2 海绵共生放线菌的分离及抗MRSA 活性菌株的筛选
• 3.1.3 菌株HA01041、HA01184 的传代稳定性
• 3.2 菌株HA01041 和HA01184 的分类鉴定
• 3.2.1 形态学特征和培养特征
• 3.2.2 生理生化特征
• 3.2.3 菌株HA01041 和HA01184 16S rDNA 序列测定
• 3.2.4 菌株HA01041 和HA01184 系统发育分析
• 3.3 菌株HA01041 和HA01184 发酵条件的优化
• 3.3.1 培养基组成对菌株 HA01041 和 HA01184 活性的影响
• 3.3.2 培养条件对菌株 HA01041 和 HA01184 活性的影响
• 3.4 活性物质的部分理化性质研究
• 3.4.1 稳定性
• 3.4.2 活性物质的萃取和溶解性
• 4 讨论
• 4.1 海绵共生放线菌的分离
• 4.2 抗 MRSA 海绵共生放线菌的筛选
• 4.3 放线菌的分类鉴定
• 4.4 菌株的发酵优化
• 5 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢