灯盏花素脂质体的研究

论文题目: 灯盏花素脂质体的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 药剂学

作者: 钟海军

导师: 邓英杰

关键词: 灯盏花素,脂质体,分子间相互作用,三甲基壳聚糖盐酸盐,包衣,多囊脂质体,口服,生物利用度,肌肉注射,缓控释,体内外相关性

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 灯盏花素是从菊科飞蓬属植物灯盏花[Erigeron breviscapus （Vant．） Hand-Mazz]中提取分离的黄酮类有效成份，是以灯盏乙素（scutellarin）为主，含少量甲素（apigenin-7-0-glucuronide）及其它黄酮类成分的混合物。灯盏花素具有扩张血管、增加脑血流量和心脏冠脉流量、降低血液粘度、抑制血小板聚集、改善微循环等作用。其现有制剂，如片剂、注射剂等，临床上主要用于治疗脑血栓、脑梗塞、中风后瘫痪、冠心病、心绞痛等疾病，疗效确切。近几年来，灯盏花素在我国已成为药物研发的一个热点，从2001年起，已经公开的有关灯盏花素的中国专利超过40个，其中一半以上针对灯盏花素的新剂型创新。灯盏花素口服给药生物利用度低，注射或口服给药后在体内均迅速消除。本论文的主要研究目的，是通过脂质体新剂型的研究提高灯盏花素口服生物利用度，延长其注射给药的体内滞留时间。为此，在处方前研究的基础上，设计了灯盏花素几种不同类型的脂质体，包括灯盏花素的普通脂质体（CLB）、壳聚糖N-三甲基化衍生物（TMC）包衣脂质体（TLB）和多囊脂质体（MLB）。首先，进行了灯盏花素的处方前研究工作，测定了灯盏花素电离常数pKa、真实油水分配系数、在不同溶剂以及不同pH水溶液中的溶解度，同时研究了灯盏花素在水溶液中的稳定性。结果表明，该药物是一个弱酸，pKa为3.29，在水中的溶解度受pH的影响很大，真实正辛醇／水分配系数为0.27，在各种有机溶剂中的溶解度较小。在25℃时，灯盏花素在pH 2～5水溶液中较稳定，在37℃时，pH 3～5较稳定，在水中存在专属性酸、碱催化降解机制。EDTA-2Na和NaHSO3可以明显提高灯盏花素在水中的稳定性，两者合用比单用其中一种效果更好。在乙醇注入法的基础上，采用冷冻干燥-水化重建法制备了用于肌注给药的CLB，采用喷雾干燥-水化重建法制备了用于口服给药的CLB。通过单因素和正交试验，较为细致地考察了各种因素对乙醇注入法制备CLB包封率的影响，结果表明，磷脂浓度、水相介质种类及离子强度对CLB包封率影响较大，而其它因素影响较小，最后得到了包封率高的CLB，并对其性质进行了研究。该脂质体体外药物释放速度较快，室温放置稳定性需要进一步提高。冻干与喷干对脂质体有关性质影响的研究结果表明，采用冻干保护剂后加的方式制备，冻干重建的脂质体包封率高；加入冻干保护剂冻干的脂质体，重建后粒径稍微增大，药物在体外释放也较快。采用支持剂后加、喷前除去乙醇的方法制备，喷干-水化重建的脂质体包封率高；当支持剂用量适当时，喷干对脂质体粒径影响不明显；喷干过程对磷脂和药物的稳定性无显著影响。建立了稳定、快速、准确的灯盏花素血浆样品分析方法用于灯盏花素脂质体的药动学评价。通过冷冻贮存前在血浆样品中和在进样分析时用于溶解已处理好的样品的溶剂中加入NaHSO3和EDTA，提高了样品在贮存和分析放置过程中的稳定性。CLB大鼠口服药物动力学研究表明，CLB和灯盏花素溶液（BS）药物的平均绝对生物利用F（％）分别为14.96％、4.77％，CLB的Cmax和AUC（0→t）较BS分别提高2.27、2.13倍，统计分析有显著性差异（P＜0.001）。大鼠肌肉注射给药的药动学研究结果显示，CLB的药物平均滞留时间(MRT（0→t）)，较BS延长了2.29倍，统计分析有显著性差异（P＜0.001）。灯盏花素脂质体中，很可能存在药物与磷脂分子之间的相互作用。为了证明这种推测并阐明其机理，并且对研究过程所出现的一些现象进行解释，采用脂质体／水分配系数、顺磁共振（EPR）、热分析（DSC）、红外光谱（IR）等手段，对灯盏花素脂质体中药物与磷脂的相互作用进行了研究。结果表明，在脂质体中灯盏花素与磷脂膜的作用力中疏水力的作用较小，而其它力（如氢键、静电等）占很大比例。在脂质体的脂质双层中，灯盏花素主要处于靠近磷脂极性头基的位置，而没有进入脂质双层的碳氢双链区域。灯盏花素分子中的羧基阴离子与磷脂分子胆碱部分中带正电性的季胺部位可能有离子间静电相互作用，灯盏花素的酚羟基与磷脂的P-O-基之间形成了氢键。通过以上研究对前面的一些实验结果进行了解释。为进一步提高灯盏花素的生物利用度，合成了具有一定吸收促进效应，又有一定生物粘附性的N-三甲基壳聚糖盐酸盐（TMC），并用其对灯盏花素脂质体包衣，以进一步探索提高口服难以吸收的小分子药物生物利用度的方法和手段。研究结果表明，所得合成产物TMC的三甲基取代度为36.8％，TMC在中性或偏碱性介质中的溶解能力较壳聚糖明显提高。随着TMC浓度增加，TLB粒径增大。提示在脂质体表面TMC包衣层的形成。在4℃冰箱6个月的放置期间，不同浓度的TMC包衣所得的TLB均较为稳定。而又以0.5％（w／v）TMC所得的TLB物理稳定性最好。TMC包衣后，脂质体的药物包封率与包衣前相比没有明显变化。采用透射电子显微镜观察结果表明，0.5％TMC所得的TLB没有聚集，形态保持球形。TLB的药物释放总体比CLB慢，而且释放更彻底。在用不同浓度TMC包衣所得的TLB中，0.5％TMC药物释放最慢。TLB显示一定的生物粘附性。TLB提高了灯盏花素的口服生物利用度，TLB大鼠灌胃给药后药物的绝对生物利用度F（％）为21.48％，是BS的4.50倍，CLB的1.44倍。CLB肌注后药物平均滞留时间（MRT）虽然较BS延长了2.29倍，但也只有6～7小时，从给药频率看，至少还需要一天一次，比较频繁。为此，在选择合适制备工艺的基础上，通过单因素试验和正交试验筛选优化处方，制备了MLB并对其进行体内外评价，以研究制备效果更好的灯盏花素可注射缓控释新剂型，减少给药次数，方便患者。MLB的制备与性质研究结果表明，磷脂、胆固醇和三甘油酯等的用量在一定范围内对药物包封率影响较大，而脂药比影响较小。最优处方制备的MLB体外释放较慢，持续时间达6 d。大鼠药动学研究结果表明，MLB药物平均滞留时间（MRT）达到32.98 h，是BS的16.6倍，CLB的5.04倍，体内药物缓释的持续时间能够达到4～5 d。MLB的体内外相关性较好（r=0.9834），为选用人血浆作为释放介质的合理性提供了一个佐证。病理切片研究表明，MLB和CLB的生物相容性均良好。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩略语

实验仪器、试药、试剂、材料和动物

前言

一、灯盏花素的药理作用

二、灯盏花素的临床应用

三、灯盏花素的体内药动学特点

四、灯盏花素新剂型的研究进展

五、脂质体在提高药物口服吸收中的应用

六、壳聚糖及其三甲基衍生物包衣脂质体增大药物吸收的作用

七、普通脂质体肌肉注射用于药物的缓控释

八、用于药物缓控释的多囊脂质体

1. 多囊脂质体的形态结构

2. 多囊脂质体的体内外释放及其机制

九、本论文的研究思路

参考文献

第一章灯盏花素处方前理化性质的研究

1.1 分析方法

1.1.1 紫外光谱扫描

1.1.2 色谱条件

1.1.3 标准曲线

1.1.4 精密度、准确度

1.2 灯盏花素在不同溶剂中的溶解度测定

1.3 灯盏花素在不同pH水溶液中的溶解度测定

1.4 灯盏花素电离常数pKa的测定

1.5 灯盏花素油/水分配系数的测定

1.6 灯盏花素水溶液的稳定性的研究

1.7 讨论

1.7.1 灯盏花素在不同有机溶剂中的溶解度

1.7.2 灯盏花素的电离常数和在不同pH介质中溶解度

1.7.3 灯盏花素水溶液稳定性

1.8 本章小结

参考文献

第二章灯盏花素普通脂质体的制备和性质

2.1 灯盏花素普通脂质体(CLB)包封率的测定方法

2.1.1 紫外分光光度法测定 CLB中药物浓度

2.1.1.1 方法专属性

2.1.1.2 标准曲线

2.1.1.3 精密度

2.1.1.4 回收率

2.1.2 高效液相色谱法测定 CLB中药物浓度

2.1.2.1 色谱条件

2.1.2.2 方法专属性

2.1.2.3 标准曲线

2.1.2.4 精密度

2.1.2.5 回收率

2.1.3 两种方法测定CLB中药物浓度的比较

2.1.4 超滤法分离 CLB中的游离药物

2.1.4.1 空白回收率

2.1.4.2 加样回收率

2.1.5 讨论

2.2 CLB的制备方法选择

2.3 乙醇注入法制备 CLB

2.3.1 处方筛选

2.3.1.1 磷脂浓度对包封率的影响

2.3.1.2 介质种类及离子强度对包封率的影响

2.3.1.3 水相pH值对包封率的影响

2.3.1.4 水相含蔗糖等糖类物质对包封率的影响

2.3.1.5 药脂比对包封率的影响

2.3.1.6 磷脂与胆固醇比例对包封率的影响

2.3.1.7 挤出对包封率的影响

2.3.1.8 正交试验筛选与优化处方

2.3.2 乙醇注入法所得 CLB的理化性质

2.3.2.1 脂质体的形态

2.3.2.2 脂质体粒径

2.3.2.3 脂质体的体外释放

2.3.2.4 胆固醇的用量对药物释放的影响

2.3.2.5 脂质体的稳定性

2.3.3 讨论

2.4 CLB的冻干

2.4.1 冻干保护剂加入方法对包封率的影响

2.4.2 冻干对脂质体粒径的影响

2.4.3 冻干-重建脂质体的体外释放

2.4.4 蔗糖对脂质体体外释放的影响

2.4.5 冻干脂质体的稳定性

2.4.6 讨论

2.5 喷雾干燥法制备灯盏花素前体脂质体

2.5.1 制备方法

2.5.2 载体的选择

2.5.3 制备方法的选择

2.5.4 支持剂与磷脂比例的选择

2.5.5 喷干温度对磷脂稳定性的影响

2.5.6 喷干对药物稳定性的影响

2.5.7 讨论

2.6 本章小结

参考文献

第三章灯盏花素普通脂质体的药动学研究

3.1 体内血药浓度分析方法的建立

3.1.1 血浆样品分析方法

3.1.1.1 色谱条件

3.1.1.2 血浆样品处理方法

3.1.2 分析方法确证

3.1.2.1 方法专属性

3.1.2.2 标准曲线和线性范围

3.1.2.3 精密度与准确度

3.1.2.4 萃取回收率

3.1.2.5 样品稳定性

3.1.2.6 稀释的影响

3.1.3 讨论

3.1.3.1 内标的选择

3.1.3.2 流动相的选择

3.1.3.3 样品稳定性

3.2 灯盏花素溶液(BS)大鼠静脉注射的药动学研究

3.2.1 给药方案与样品采集

3.2.2 血浆样品分析方法

3.2.3 数据处理

3.2.4 实验结果

3.2.5 讨论

3.3 灯盏花素普通脂质体(CLB)大鼠口服药动学研究

3.3.1 给药方案与样品采集

3.3.2 血浆样品分析方法

3.3.3 数据处理

3.3.4 实验结果

3.3.5 讨论

3.4 CLB大鼠肌肉注射药动学研究

3.4.1 给药方案与样品采集

3.4.2 血浆样品分析方法

3.4.3 数据处理

3.4.4 实验结果

3.4.5 讨论

3.5 本章小结

参考文献

第四章灯盏花素脂质体中药物与磷脂的相互作用

4.1 通过灯盏花素脂质体/水分配系数研究药物与磷脂的相互作用

4.1.1 灯盏花素在不同pH条件下油/水分配系数的测定

4.1.2 灯盏花素脂质体/水分配系数的测定

4.1.2.1 PH对脂质体/水分配系数的影响

4.1.2.2 磷脂浓度对脂质体/水分配系数的影响

4.1.3 讨论

4.1.3.1 脂质体/水分配系数用于初步探讨灯盏花素与磷脂的分子间相互作用机理

4.1.3.2 磷脂浓度对灯盏花素脂质体包封率影响的解释

4.2 通过顺磁共振谱(EPR)研究灯盏花素与磷脂的相互作用

4.2.1 实验原理

4.2.2 实验方法

4.2.2.1 自旋标记脂质体的制备

4.2.2.2 EPR实验条件

4.2.3 实验结果

4.2.4 讨论

4.3 通过热分析(DSC)研究灯盏花素与磷脂的相互作用

4.3.1 实验方法

4.3.2 实验结果

4.3.3 讨论

4.4 通过红外光谱(IR)研究灯盏花素与磷脂的相互作用

4.4.1 实验方法

4.4.2 实验结果

4.4.3 讨论

4.5 综合分析

4.6 本章小结

参考文献

第五章 N-三甲基壳聚糖包衣灯盏花素脂质体的研究

5.1 N-三甲基壳聚糖(TMC)的合成与表征

5.1.1 TMC的合成

5.1.2 TMC的 IR谱

5.1.3 TMC的~1H NMR谱

5.1.4 TMC的三甲基取代度

5.1.5 TMC的溶解性试验

5.1.6 讨论

5.1.6.1 壳聚糖及其 N-三甲基化衍生物(TMC)

5.1.6.2 合成 TMC一些特性参数的选择

5.2 TMC包衣灯盏花素脂质体(TLB)的制备和性质

5.2.1 TMC包衣脂质体的制备

5.2.2 灯盏花素普通脂质体 TMC包衣前后药物包封率的变化

5.2.3 TMC浓度对包衣脂质体稳定性的影响

5.2.4 TMC用量对包衣脂质体粒径的影响

5.2.5 TLB的形态

5.2.6 体外释放

5.2.7 TLB的生物粘附性

5.2.7.1 磷脂的测定

5.2.7.2 生物粘附性的研究

5.2.8 讨论

5.3 N-三甲基壳聚糖包衣灯盏花素脂质体(TLB)的药动学评价

5.3.1 给药方案与样品采集

5.3.2 血浆样品分析方法

5.3.3 数据处理

5.3.4 实验结果

5.3.5 讨论

5.4 本章小结

参考文献

第六章灯盏花素多囊脂质体的研究

6.1 灯盏花素多囊脂质体(MLB)包封率的测定方法

6.1.1 MLB包封药物的分离测定方法

6.1.2 MLB中总药物的测定方法

6.1.2.1 色谱条件

6.1.2.2 方法专属性

6.1.2.3 标准曲线

6.1.2.4 精密度

6.1.2.5 回收率

6.2 MLB的制备工艺

6.2.1 制备方法

6.2.2 制备条件的选择

6.2.2.1 搅拌速度和时间

6.2.2.2 温度

6.2.2.3 氮气除有机溶剂的速度

6.2.3 讨论

6.3 MLB的处方筛选

6.3.1 磷脂用量对 MLB包封率的影响

6.3.2 PG用量对MLB包封率的影响

6.3.3 胆固醇用量对 MLB包封率的影响

6.3.4 三油酸甘油酯(TO)用量对 MLB包封率的影响

6.3.5 脂药比对 MLB包封率的影响

6.3.6 TO与三辛酸甘油酯(TC)之比对 MLB包封率的影响

6.3.7 正交试验筛选与优化处方

6.3.8 讨论

6.4 MLB的性质

6.4.1 MLB的形态

6.4.2 MLB的粒径

6.4.3 MLB的体外释放

6.4.4 TO与TC之比对药物释放的影响

6.4.5 讨论

6.4.5.1 多囊脂质体的形态结构与粒径

6.4.5.2 MLB的体外释放

6.5 MLB的药动学评价

6.5.1 给药方案与样品采集

6.5.2 血浆样品分析方法

6.5.3 数据处理

6.5.4 实验结果

6.5.5 讨论

6.5.5.1 MLB的药动学特征

6.5.5.2 MLB的体内外相关性

6.6 脂质体肌肉注射的生物相容性研究

6.6.1 动物分组

6.6.2 组织检查方法

6.6.3 结果与讨论

6.7 本章小结

参考文献

全文结论

致谢

作者简介

发布时间: 2006-12-14

参考文献

[1].灯盏花素的心肌保护作用及其机制研究[D]. 李小龙.浙江大学2004
[2].中药肠吸收动力学的研究——灯盏花素肠吸收动力学的研究[D]. 唐灿.成都中医药大学2004
[3].灯盏花素抑制血管平滑肌细胞增殖的分子基础研究[D]. 钱传云.昆明医学院2006
[4].莪术醇肝靶向脂质体的制备及其抗肿瘤研究[D]. 李文杰.广州中医药大学2014
[5].丹参酮ⅡA、丹酚酸B与甘草次酸复方脂质体构建及体内外评价研究[D]. 林珈好.北京中医药大学2014
[6].靶向星形细胞的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d复方脂质体制备工艺研究及体内外评价[D]. 张国松.北京中医药大学2015
[7].半乳糖化胆固醇配体脂质体材料的酶促构建及其肝靶向性研究[D]. 聂华.广州中医药大学2014
[8].足叶乙苷长循环脂质体制备及抑瘤性研究[D]. 时军.广州中医药大学2009

灯盏花素脂质体的研究

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