萝卜自交不亲和性测定与相关基因的鉴定

论文摘要

萝卜杂种优势明显，自交不亲和是萝卜杂交优势利用的一种重要途径。本研究结合亲和指数法与荧光显微观察法对高代自交材料进行自交不亲和测定。利用SLG和SRK的特异引物，通过限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）研究萝卜的SLG和SRK基因，并对材料的SLG和SRK基因进行克隆验证。为萝卜自交不亲和性杂优利用、了解SLG和SRK基因在十字花科中的进化、萝卜自交不亲和性机理的研究奠定基础。1以萝卜高代自交系为试材，利用荧光显微镜观察其花期和蕾期自花授粉不同时期柱头与花柱，结果发现自交不亲和与自交亲和材料花粉萌发和花粉管伸长状况存在明显差异。自交不亲和材料花期授粉后柱头上出现严重的胼胝质反应，花粉很少萌发，即使萌发也不能正常生长，出现弯曲或背向生长，花粉管顶端膨大不能穿越柱头乳突细胞；自交亲和系萝卜单株花期、蕾期以及自交不亲和系单株蕾期授粉后花粉多数能够正常萌发并穿越柱头进入子房。对供试材料进行了田间自交亲和指数测定，与荧光显微镜测定法鉴定结果高度一致。因此利用荧光显微镜观察法可以准确快速鉴定萝卜的自交不亲和性，从而提高优良自交不亲和系选育效率。2萝卜S位点糖蛋白基因（SLG）和S位点受体激酶（SRK）基因参与了花粉和柱头之间的自交不亲和反应。设计SLG和SRK特异引物，利用PCR-RFLP技术对SLG和SRK基因的多态性进行分析。根据classⅠSLG特异引物扩增产物限制性内切酶酶切后DNA多态性，19个自交系被分为12个S单元型；SRK特异引物扩增酶切后，20个自交系也分为13个S单元型。classⅡSLG特异引物扩增产物限制性内切酶酶切后，根据DNA多态性17个自交系被分为6个S单元型。因此PCR-RFLP技术在区分萝卜S单元型中有着重要作用。对5个SLG等位基因和6个SRK等位基因的DNA序列进行了验证，研究发现氨基酸序列与甘蓝SLG6基因的相似性达80.72％～84.26％，SRK基因与甘蓝中SRK3基因也具有很高的相似性。分析萝卜和甘蓝的SLG序列发现，萝卜的SLG基因并不自己独立成一组，而是分散在树形图中，说明SLG单元型分化在萝卜属和芸薹属分类之前。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物孢子体型自交不亲和性的研究进展
• 1 植物自交不亲和性概述
• 2 植物自交不亲和性的遗传控制
• 2.1 配子体型自交不亲和
• 2.2 孢子体型自交不亲和
• 3 植物孢子体型自交不亲和性基因的研究进展
• 3.1 孢子体型自交不亲和反应的发育控制阶段
• 3.2 S复等位基因及其相互关系
• 3.3 S位点特异糖蛋白（SLG）分析
• 3.4 SRK基因分析
• 3.5 花粉中表达的 S基因 SCR/SP11
• 3.6 SLG-SCR-SRK与自交不亲和的关系
• 3.7 编码基因与 S位点非连锁的功能分子
• 3.7.1 ARC1
• 3.7.2 SLR
• 3.7.3 水孔蛋白MOD
• 3.7.4 THL1/THL2
• 2+'>3.7.5 Ca²⁺
• 3.7.6 BPC1
• 3.8 SSI的SI的反应机制
• 3.9 SSI的S单元型之间显隐性关系和分类
• 4 植物孢子体型自交不亲和测定方法的研究进展
• 4.1 亲和指数法
• 4.2 荧光显微法
• 4.3 等电聚焦电泳法
• 4.4 免疫测定法
• 4.5 PCR-RFLP分析法
• 5 萝卜自交不亲和研究进展
• 5.1 萝卜自交不亲和研究的意义
• 5.2 萝卜自交不亲和的田间鉴定
• 5.3 萝卜自交不亲和基因的研究
• 5.4 结语与展望
• 第二部分 研究报告
• 第二章 萝卜自交不亲和特性的快速鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 自交不亲和性荧光显微镜观察
• 1.3 自交不亲和性亲和指数测定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同亲和性材料柱头—花粉相互作用
• 2.2 亲和指数分析
• 2.3 两种测定方法相关性分析
• 3 讨论
• 第三章 萝卜自交不亲和性 S单元型鉴定和分类
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 PCR-RFLP分析
• 1.2.1 基因组 DNA提取
• 1.2.2 药品配制
• 1.2.3 SLG与 SRK基因PCR反应
• 1.2.3.1 引物设计
• 1.2.3.2 反应液的配制
• 1.2.3.3 PCR反应体系
• 1.2.3.4 PCR产物的检测
• 1.2.4 目的片段的限制性酶切
• 1.2.5 酶切结果的检测
• 1.3 SLG和 SRK基因克隆与分析
• 1.3.1 特异片段的扩增
• 1.3.2 目的片段的回收
• 1.3.3 感受态大肠杆菌 JM109的制备
• 1.3.4 重组质粒的构建
• 1.3.5 重组质粒的转化
• 1.3.6 质粒的提取及重组质粒的鉴定
• 1.3.7 序列测定及分析
• 2 结果分析
• 2.1 DNA的提取
• 2.2 SLG和 SRK基因PCR-RFLP分析
• 2.2.1 SLG和 SRK基因的PCR扩增
• 2.2.2 目的片段的限制性酶切
• 2.3 SLG和 SRK基因克隆
• 2.3.1 SLG和 SRK基因的PCR扩增
• 2.3.2 酶切位点分析
• 2.3.3 SLG和 SRK的核苷酸及氨基酸序列比较分析
• 2.3.4 系统发育树的构建
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢