论文摘要
目的:建立表达GFP的MDA-MB-231乳腺癌细胞骨转移动物模型,应用pC89噬菌体肽库体技术,筛选能特异性进入乳腺癌MDA-MB-231原代细胞及骨转移细胞的小肽,探讨其作为肿瘤靶向治疗载体的可行性,为提高乳腺癌骨转移治疗率及探讨乳腺癌体化治疗提供实验依据。方法:将带有GFP表达基因的质粒PEGFP-N2采用脂质体转染法转染入处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,获得稳定表达GFP的MDA-MB-231/GFP细胞。扩增培养MDA-MB-231/GFP细胞,左心室注射裸鼠每只1×107个/0.2ml。45天后,小鼠行X线/PET-CT检查,确定骨转移部位。并同时取部分转移灶进行组织培养并在荧光显微镜观察细胞表达GFP情况。扩增培养PC89噬菌体肽库,使其扩增后的滴度达1011TU。将原代乳腺癌细胞以及从转移灶取得的乳腺癌细胞的肿瘤与pC89噬菌体肽库体外共培养。Subtilisin被用于灭活未进入细胞的噬菌体,进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E.coli XLI-Blue得到扩增。经过五轮的反复共培养和扩增,富集得到能特异性进入乳腺癌细胞的小肽噬菌体。选用RGD-integrin binding噬菌体作为对照,分别检测乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株、其他组织来源实体瘤细胞株以及正常细胞株的亲和性。测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特异性多肽并标记FITC,排除噬菌体外壳蛋白以及氨基酸序列在特异性转导中的作用。将编码乳腺癌细胞特异性多肽的DNA片段定向插入能够表达GST融合蛋白的质粒pGEX-2T,构建原核表达载体,小肽与GST融合蛋白表达用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定,抗GST单克隆抗体免疫荧光检测小肽介导GST蛋白进入人乳腺癌原代细胞或从转移灶取得的乳腺癌细胞的能力,探讨特异性小肽作为靶向载体的携带能力。结果:用PEGPF-N2转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,获得稳定表达细胞进行裸鼠心腔注射,62.5%的裸鼠出现胸廓和肋骨等处的转移。将亲代MDA-MB-231细胞和转移灶MDA-MB-231细胞分别与PC89噬菌体库体外培养,筛选获得五个能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体,经DNA测序确定它们分别是CASPSGALRSC（PⅠ）,CFPVPGHDLVC（PⅡ）,CFSVPGHDIVC（PⅢ）,CYTYPLGWHIC（PⅣ）和CTPMSLSLSEC（PⅤ）。嵌合蛋白（RGD-integrin）作为阳性对照研究发现,筛选的小肽噬菌体与其他大多数肿瘤细胞及正常细胞无特殊亲和性:PⅠ显示与亲代细胞和转移灶细胞均能高特异性结合,而PⅡ主要与转移灶细胞高特异性结合,并发现它们在细胞中的分布主要以核周为主。进一步研究发现噬菌体外壳蛋白对小肽的特异亲和性无影响,合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列保持与原代细胞及及转移细胞的亲和特异性。成功构建pGEX-2T-PⅠ和pGEX-2T-PⅡ原核表达载体,并在大肠杆菌中分别表达融合蛋白PⅠ-GST和融合蛋白PⅡ-GST,两者经GST亲和层析,纯度达85%。免疫荧光显示PⅠ-GST进入MDA-MB-231亲代细胞和骨转移细胞中。结论:本实验建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知小肽的技术;得到了一条能与原代细胞及转移细胞MDA-MB-231高特异性结合的小肽,并具有携带外源性蛋白质分子靶向性进入目标细胞的能力。这种特异性呈现氨基酸小肽序列高度依赖性。该小肽具有作为乳腺癌基因治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值。同时,本研究为肿瘤细胞特异性抗原或抗体的研究提供理论和实验依据。
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标签：乳腺癌论文; 骨转移论文; 动物模型论文; 噬菌体肽库论文; 小肽论文; 载体论文; 蛋白转导论文; 靶向治疗论文;