五龄柞蚕后部丝腺差异表达蛋白研究

论文摘要

柞蚕是一种典型的野蚕,其丝腺能够合成和分泌丝蛋白。在五龄期,柞蚕幼虫大量合成和分泌丝素蛋白,后部丝腺的亚细胞结构和新陈代谢也发生了很大的变化。为研究差异表达蛋白在丝素蛋白准备和合成过程中所起的作用,本论文通过双向电泳和质谱的方法分离和鉴定了五龄柞蚕幼虫丝腺中表达量上调的蛋白,并通过实时定量PCR检测了其中两个蛋白的RNA表达变化。样品的准备是双向凝胶电泳鉴定成功与否的关键一步。为得到较高分辨率的蛋白电泳图谱,实验通过优化,选用两步提取法提取柞蚕丝腺组织蛋白,将水溶性蛋白和微溶或不溶的蛋白分开,防止高丰度蛋白对双向电泳的影响;并用2D clean-up试剂盒对蛋白溶液进行了预处理,减少了横条纹。实验采用载体两性电解质进行等点聚焦,建立了一套简单经济的双向电泳方法,并对柞蚕丝腺蛋白双向电泳的条件进行了优化,得到此系统的最佳上样量为:30μg;最佳pH范围:pH4～7;最佳聚焦条件:1000V,3h。通过和五龄一天柞蚕丝腺蛋白的双向电泳图谱相比较发现:在五龄四天时蛋白表达有较大的差异。采用IPG固化胶条进行双向电泳,得到了分辨率较高的五龄一天和四天柞蚕丝腺蛋白双向电泳图谱,每张图谱检测到大约350个蛋白点。通过Imagemaster软件进行比对分析,选取了23个在五龄四天特异表达或表达量上调两倍以上的蛋白进行MALDI-TOF-MS鉴定,得到了7个已知蛋白,这些蛋白在转录、翻译和细胞新陈代谢中起着重要的作用。实验对其中的两个蛋白基因（谷胱甘肽硫转移酶和核糖体蛋白L8）进行了克隆,获得了Genbank登录号为EU541490和EU541491。另外,通过实时定量PCR对这两个蛋白进行了RNA转录水平分析,结果发现,RNA表达水平和蛋白表达水平相一致。

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摘要

Abstract

1 文献综述

1.1 蛋白质组学

1.1.1 蛋白质组学的主要研究技术

1.1.2 比较蛋白质组学及其研究进展

1.2 样品处理

1.2.1 样品预分离

1.2.2 蛋白提取

1.2.3 干扰物去除

1.3 双向电泳技术

1.3.1 一向等电聚焦电泳

1.3.2 二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.3.3 染色方法

1.3.4 双向电泳研究进展

1.4 蛋白质组学在昆虫中的应用

1.4.1 在模式昆虫中的应用

1.4.2 在非模式昆虫中的应用

1.4.3 展望

1.5 柞蚕

1.5.1 柞蚕简介

1.5.2 丝腺及其功能

1.6 本实验的研究意义

2 柞蚕丝腺蛋白提取

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.1.1 柞蚕丝腺材料准备

2.2.2 丝腺蛋白的提取

2.2.3 蛋白质定量

2.3 结果与讨论

2.3.1 柞蚕丝腺蛋白提取

2.3.2 蛋白浓度的测定

2.4 本章小结

3 柞蚕丝腺蛋白双向电泳条件的建立与优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 第一向等电聚焦

3.2.2 第一向胶条的平衡

3.2.3 第二向SDS-PAGE

3.2.4 染色

3.2.5 pH范围的选择

3.2.6 加样量对第一向等电聚焦的影响

3.2.7 聚焦时间对双向电泳图谱的影响

3.2.8 样品预处理改善横条纹

3.3 结果与讨论

3.3.1 双向电泳结果

3.3.2 pH范围的选择

3.3.3 加样量对第一向等电聚焦的影响

3.3.4 聚焦时间对双向电泳图谱的影响

3.3.5 样品预处理改善横条纹

3.4 本章小结

4 五龄柞蚕后部丝腺差异表达蛋白鉴定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 第一向等电聚焦

4.2.2 第二向SDS-PAGE

4.2.3 染色

4.2.4 双向电泳图谱比对

4.2.5 肽指纹图谱分析

4.2.6 数据库查询

4.3 结果与讨论

4.3.1 双向电泳图谱比对

4.3.2 质谱分析鉴定

4.3.3 表达量上调蛋白分析

4.4 本章小结

5 GSTT和RPL8的克隆以及RNA水平分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 柞蚕丝腺总RNA提取

5.2.2 引物设计及RT-PCR

5.2.3 基因克隆及鉴定

5.2.4 实时定量PCR分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 柞蚕GSTT和RPL8基因的扩增结果

5.3.2 柞蚕GSTT和RPL8基因的序列分析

5.3.3 柞蚕GSTT和RPL8基因的同源性与进化分析

5.3.4 柞蚕GSTT和RPL8基因的表达变化规律分析

5.4 本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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