论文摘要
生物的嗅觉系统能识别和区分成千上万种不同的气味分子,具有很高的灵敏度和特异性。嗅觉和视觉、听觉一样,对大多数动物的生存具有重要的意义。生物界中大多数有机体依赖嗅觉进行觅食、躲避天敌和交配等。自从嗅觉受体基因超家族首次被发现并克隆,嗅觉感知机制被阐明以来,人们对嗅觉的研究越来越感兴趣。嗅觉感知,以哺乳动物为例,起始于嗅觉受体蛋白与气味分子的结合,受体配体结合物激活细胞内G-蛋白,引起细胞内发生一系列的生物化学级联效应,细胞产生动作电位,将气味分子的化学信号转导成动作电位的电信号,通过轴突把嗅觉信号传导到嗅球,经过加工和修饰,输入到大脑皮层的嗅觉信号处理中枢,在这里完成嗅觉信号的解码,从而形成对气味的感知,实现气味的识别和辨别。嗅觉受体蛋白在气味感知过程中起着重要的作用,它属于G-蛋白偶联受体超家族,有7个跨膜区域。而嗅觉受体基因不含N-末端信号肽序列,当克隆的嗅觉受体基因在异源细胞系统中表达时,翻译后的蛋白因缺乏信号肽的引导,在内质网内滞留、聚集,甚至在蛋白酶的作用下降解,最终无法定位在细胞膜上。这也是目前研究嗅觉受体蛋白异源表达的热点之一随着嗅觉感知机理的阐明,人们通过模仿嗅觉系统识别和分辨气味的机理,以生物活性组分,如嗅觉受体神经元、嗅觉受体蛋白等作为识别元件,结合各种二级传感器,构建了多种仿生嗅觉传感器。仿生嗅觉传感器具有灵敏度高、响应速度快、选择性好等特点,可广泛应用于生物医学、环境监测、药物开发、食品和水源质量控制等诸多领域,具有潜在的工业应用前景和商业价值。同时仿生嗅觉传感器也为嗅觉传导机理的深入研究提供了新的技术手段,如用于鉴定特异的嗅觉受体-配体对、研究嗅神经元对刺激的响应特性、细胞电生理等,从而促进嗅觉传导机理的研究。石英晶体微天平（quartz crystal microbalance, QCM）是一种质量敏感型传感器,其检测谐振频率的改变△f与传感器表面的质量变化△m成线性关系,因而作为一种灵敏的检测手段被广泛用于生物微质量检测。近年来,该类传感器结合生物特异性识别材料构成生物传感器,实现了细菌、蛋白、小分子的微量变化差异的检测。研究目的：通过分子生物学的方法构建线虫嗅觉受体基因odr-10真核表达载体,在异源细胞系统人胚胎肾细胞（HEK-293）中表达ODR-10蛋白,为构建仿生嗅觉传感器提供识别元件—嗅觉受体蛋白。研究方法：将含有his标签和rho信号肽的序列插入到odr-10基因的N-端,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,得到重组质粒。通过脂质体法将重组质粒转染到HEK-293细胞中。转染48h后,分别利用逆转录PCR和Western blot方法检测目的基因和蛋白在细胞中的表达情况。细胞免疫荧光的方法检测目的蛋白在细胞质膜上的定位,之后运用钙离子成像实验,验证表达蛋白是否具有识别特异性气味配体的生物活性。最后提取目的蛋白,将其固定在生物传感器QCM电极的表面,通过添加不同气味刺激,检测蛋白的活性及验证仿生嗅觉生物传感器的功能。研究结果：通过双酶切及测序鉴定结果显示成功构建了真核表达载体his/rho/odr-10-pcDNA3.1。逆转录PCR扩增出的条带与预期目的片段大小一致,说明目的蛋白在RNA水平有表达,同时Western blot结果显示目的蛋白在细胞中有表达。细胞免疫荧光实验也证实目的蛋白表达在细胞质膜上。钙离子成像实验通过激光共聚焦显微镜的观察,结果显示在添加刺激时细胞内荧光增强,说明目的蛋白能识别其特异性配体丁二酮。QCM传感器检测结果显示提取的目的蛋白具有识别气味配体的生物活性,基于嗅觉受体蛋白ODR-10的QCM生物传感器能特异性地识别气味分子。研究结论：成功的在异源细胞系统HEK-293细胞中表达了线虫嗅觉受体蛋白ODR-10,基于ODR-10蛋白的QCM生物传感器具有识别气味分子的功能,为构建仿生嗅觉传感器打下基础。