siRNA沉默TPX2基因对宫颈癌Hela细胞生物学行为的研究

论文摘要

目的：在妇女常见癌症中，宫颈癌的发病率在世界范围内位居第二，在发展中国家，死于癌症妇女的最主要病因就是宫颈癌。据2001年WHO的报道，全球每年新增约50万宫颈癌确诊病例，同时有超过25万妇女死于该病。在我国，每年约13.15万妇女罹患宫颈癌，而每年死亡病例约3万人。近几十年来，通过广泛开展宫颈癌筛查工作，使该病的发病率呈明显的下降趋势，但近年来，由于生活方式的改变，使宫颈癌的发病率重新呈现上升的趋势，并且有逐渐年轻化的趋势。因此，宫颈癌仍严重威胁世界各国妇女的生命健康，防治任务十分艰巨。近年来，随着对宫颈癌发生发展机制的深入研究，该病是一种基因病的观点逐渐被大众接受。因此，从分子生物学水平纠正促使肿瘤发生的基因改变成为治疗宫颈癌的新途径。TPX2是Xklp2的靶蛋白，是一种微管相关蛋白。其表达和分布受细胞周期的严格调控，与体内多种有丝分裂因子相互调节，在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用。有研究表明多种人类肿瘤中都存在TPX2的过表达，其过量表达影响纺锤体的正常形成与分离，导致异倍体的形成，并与肿瘤的侵袭性和预后相关。因此，本实验借助特异TPX2基因的siRNA作用于宫颈癌Hela细胞株，探讨干扰宫颈癌中TPX2基因的表达后，是否可以阻断肿瘤的生物学行为，抑制肿瘤的发生发展，为基因治疗应用于宫颈癌的临床治疗提供有价值的实验基础。方法：1Hela细胞培养：Hela细胞由河北医科大学第四医院科研中心细胞库提供，培养于含10%FBS的1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至细胞汇合度达50%-60%。2siRNA转染：本实验中所用针对TPX2的siRNA序列根据GenBank公布的人TPX2核苷酸序列NM-012122。将筛选出的具有最佳干扰效果的序列和阴性对照序列按Lipofectamine2000操作步骤进行转染。3MTT比色法检验转染了TPX2-siRNA的Hela细胞增殖活性的改变：将Hela细胞分为转染组、空白对照组和阴性对照组三组，每组设3个平行孔，将各组细胞分别接种至96孔板培养24小时，按照操作步骤进行转染，分别于转染后0小时、24小时、48小时、72小时、96小时，用酶联仪于570nm处检测各孔吸光度值，并据此绘制细胞生长曲线。4流式细胞仪检测siRNA干扰后Hela细胞的周期和凋亡情况：将Hela细胞分为转染组、空白对照组和阴性对照组三组，每组实验均重复3次，①周期：按细胞周期的检测规程进行操作，用流式细胞仪检测，并用ModFit3.0软件进行细胞周期分析；②凋亡：各组细胞按照凋亡检测步骤进行操作，经Annexin-FITC/PI双标后用流式细胞仪检测细胞凋亡。5划痕试验检测siRNA干扰后Hela细胞迁移能力的改变：将Hela细胞接种于6孔板中，培养24小时，于每孔底部划痕，按siRNA转染步骤转染细胞，将其分为转染组、阴性对照组、空白对照组，每组设3个平行孔，更换RPMI-1640培养基培养48小时，测量各孔划痕宽度变化。6Transwell体外侵袭实验测定siRNA干扰后Hela细胞侵袭能力的改变：将Hela细胞分为转染组、阴性对照组、空白对照组，每组设3个平行孔，将各组细胞滴加于Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室，培养24小时，95%乙醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数各组穿膜细胞数。7使用SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用单因素方差分析和重复测量方差分析比较各组差异，以P＜0.05为有统计学意义。结果：1在转染24小时、48小时、72小时、96小时四个检测时段，转染组细胞的A值分别为0.79±0.01、0.87±0.03、0.81±0.02、0.77±0.01，其生长速度明显降低，与阴性对照组和空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而阴性对照组和空白对照组的细胞生长速度相比，无统计学意义（P＞0.05），其生长速度无明显差异，并且在转染组，随着转染时间的延长，TPX2-siRNA对于细胞增殖的抑制作用越明显；2转染组处于G2/M期及S期的细胞比例分别为12.23%±1.27%、41.73%±0.83%，较阴性对照组及空白对照组明显增加、而G0/G1期细胞比例为46.03%±1.66%，较其他组明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而阴性对照组和空白对照组之间相比，细胞周期并无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）3转染组凋亡率为13.47%±0.60%，明显高于阴性对照组的3.48%±0.55%和空白对照组的2.73%±0.51%，差异具有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组之间的细胞凋亡率无明显差异，无统计学意义（P＞0.05）。4培养48小时后，转染组孔中划痕宽度为（1100.99±22.25）μm，明显大于阴性对照组的（535.42±11.64）μm和空白对照组的（521.07±11.19）μm，差异具有统计学意义（P＜0.05），且阴性对照组和空白对照组的划痕宽度较前明显减小，但两对照组之间划痕宽度的差异并无统计学意义（P＞0.05）。5转染组平均穿膜细胞数为（13.20±1.92），明显低于阴性对照组（55.40±2.07）和空白对照组（55.20±1.30），差异具有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组之间的穿膜细胞数并无明显差异，无统计学意义（P＞0.05）。结论：本实验证明，TPX2在宫颈癌的发生发展中起重要作用，干扰其表达可以降低宫颈癌细胞的增殖活性，使宫颈癌细胞停滞于S期和G2/M期，抑制癌细胞的侵袭和迁移，诱导癌细胞凋亡。这为宫颈癌的治疗可能提供了一个有效的分子靶点，同时也为宫颈癌的临床治疗提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 TPX2的作用及其与肿瘤关系的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历