杉木茎段皮层基因表达分析

论文摘要

利用差异显示法（DDRT-PCR）研究杉木的2个自然变异类型（句容0号及独干杉）皮层（包含周皮、韧皮部、形成层及初生木质部）基因表达差异，共获得29个差异片段，测序后进行Blast比对分析。结果表明： 1)Blastn比对（分值＞60）分析表明共有9个片段在GeneBank中找到了相似的功能。分别与核糖体蛋白基因、信号传导功能、泛素蛋白基因、抗性功能、组氨酸磷酸转移蛋白、细胞发生功能及能量代谢相关。 2)Blastx比对分析有12个序列可进行功能推测。其中7个片段和细菌、动物的功能相似，涉及膜结构、细胞因子、代谢过程中酶的活性及一些未知蛋白。 3)还有8个差异片段在数据库中未发现匹配信息。 对句容0号杉茎段皮层cDNA文库随机测序。分析表明有效EST序列1，119条，聚类分析和拼接后获得354个UniGenes。Unigene比对结果表明： 1)高度相似和中度相似的序列分别为58个和70个，低度相似和无匹配序列合计达63.8％。 2)可以推测基因功能的高丰度、中丰度及低丰度表达序列分别为5条、25条和98条。 3)基因功能：功能注释中表达的基因主要有：一类参与光合作用相关的相关基因，包括多种光合系统的组分、叶绿体a／b结合蛋白、氧捕获增强蛋白和能量传递等；另一类是与受外界胁迫表达的抗逆性相关基因。除此，表达频率较高的ARP（Auxin-RepressedProtein）可能与杉木分枝及茎的伸长有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 一 植物基因组学研究概况
• 1 植物结构基因组学
• 1.1 DNA文库的构建
• 1.2 植物基因组测序进展
• 2 植物功能基因组研究
• 2.1 植物的表达序列标签
• 2.2 植物基因功能的分析方法
• 3 生物信息学在基因组研究的应用
• 3.1 获取各种生物的完整基因组,建立相关数据库
• 3.2 生物信息学在EST数据分析中的应用
• 3.3 系统发育研究和基因组的比较研究
• 二 木本植物基因组研究进展
• 1 遗传图谱的构建
• 2 比较基因组研究
• 3 EST研究
• 4 林木材质相关基因及分枝性状基因的研究
• 4.1 与材质相关基因的研究
• 4.2 与分枝性状相关基因的研究
• 三 杉木基因组研究及本课题研究的意义
• 1 已有的研究成果
• 2 本课题研究的目的和意义
• 第二章 差异显示法（DDRT-PCR）研究杉木茎段皮层基因表达差异
• 一 实验材料
• 1 植物材料
• 2 主要实验试剂
• 3 主要仪器设备
• 二 实验方法
• 1 总RNA的提取
• 1.1 CTAB法
• 1.2 Plant RNA Reagent法
• 1.3 Trizol Reagant法
• 1.4 用RQ1 RNase-Free DNase消化DNA
• 1.5 RNA的过柱纯化
• 1.6 RNA的完整性和纯度的检测
• 2 DDRT-PCR分析
• 2.1 反转录（第一链的合成）
• 2.2 DDRT-PCR（第二链PCR扩增）
• 2.3 差显分析
• 2.4 差异片段的二次扩增
• 2.5 二次PCR产物的纯化
• 2.6 差异片段与载体的连接与转化
• 2.7 DDRT-PCR克隆片段的检测
• 2.8 反向Northern杂交
• 2.9 差显片段的序列分析
• 三 结果与分析
• 1 RNA的完整性和纯度
• 2 差异片段的获得
• 2.1 引物筛选
• 2.2 差异片段的获得
• 2.3 差异片段的大小
• 3 差异片段的二次扩增和纯化
• 4 DDRT-RT片段的克隆转化及检测
• 4.1 差异片段的克隆转化
• 4.2 菌液PCR检测
• 4.3 质粒提取和质粒酶切检测
• 5 反向Northern杂交检测差异阳性片段
• 6 序列测定与分析
• 6.1 序列测定
• 6.2 序列比对与分析
• 四 讨论
• 1 通过改进引物设计和反向Northern克服DDRT-PCR的假阳性
• 2 不同DDRT-PCR产物显示方法对实验结果的影响
• 3 本实验所获得的结果与下一步展望
• 附录
• 五 主要结论
• 第三章 杉木茎段皮层EST分析
• 一 实验材料
• 1 植物材料
• 2 主要试剂
• 二 实验方法
• 1 RNA的提取
• 2 mRNA的分离
• 2.1 mRNA抽提
• 2.2 mRNA的分析
• 3 cDNA文库的构建
• 3.1 cDNA第一链的合成
• 3.2 cDNA第二链的合成
• 3.3 补平cDNA缺口
• 3.4 连接EcoR Ⅰ接头
• 3.5 EcoR Ⅰ末端磷酸化
• 3.6 用XhoⅠ消化
• 3.7 cDNA大小片段的分级
• 3.8 cDNA和ZAP表达载体连接
• 3.9 包装
• 3.10 体外切割
• 3.11 cDNA文库质量测定
• 3.12 EST序列测定及生物信息学分析
• 三 结果与分析
• 1 RNA的抽提
• 2 mRNA的分离
• 3 凝胶柱层析纯化cDNA
• 4 cDNA样品沉淀纯化后的浓度测定
• 5 cDNA文库的质量评价
• 5.1 文库滴度
• 5.2 cDNA文库插入片段大小
• 6 EST序列测定及生物信息学分析
• 6.1 EST序列质量评估
• 6.2 EST序列的Blastn及Blastx比对分析
• 6.3 EST序列聚类及拼接
• 6.4 基因表达频率分析
• 6.5 Unigene比对结果分析
• 6.6 基因功能注释及同源序列来源分析
• 6.7 EST基因功能分类
• 6.8 EST代谢途径分析
• 7 从EST中开发SSR标记
• 四 讨论
• 1 文库质量
• 2 EST冗余度及基因表达丰度
• 3 不同比对方法对结果分析的影响
• 4 杉木茎段皮层文库中的特征基因
• 4.1 金属硫因蛋白（metallothionein-like protein,MT）
• 4.2 Auxin-repressed protein,ARP
• 4.3 bZIP转录因子
• 5 从EST序列中开发SSR标记
• 6 结合DDRT-PCR分析
• 7 本研究待改进之处及进一步研究展望
• 7.1 与数据库的同源性不高
• 7.2 杉木茎段皮层ESTs的特点
• 7.3 下一步研究展望
• 五 主要结论
• 参考文献
• 附录
• 详细摘要