竹子PIF-like转座子多样性研究和毛竹PIF-like转座子长片段基因克隆

论文摘要

转座子（Transposable elements）是指基因组中能够移动或复制,并整合到新位点的DNA片段。1948年由美国女科学家芭芭垃.麦克林托克（B.McClintock）首先在玉米中发现,其典型特征是序列末端具有两个反向重复序列（terminal inverted repeat,TIR）。转座子活跃后能插入基因或者基因调控区,潜在地破坏基因的功能,同时也能引起染色体重构。尤其是LTR类反转座子和微型反向重复转座元件（miniature inverted-repeat transposable elements,MITES）。P instability factor （PIF）是在玉米中偶然发现的具有遗传活性的DNA转座子,它与玉米Tourist-like MITE家族中的miniature PIF （mPIF）有相似的结构特征。研究PIF转座子对于了解MITE家族的起源和转座机制有很重要的意义。竹类植物尤其是毛竹作为重要的多用途森林资源,在世界各地的地区经济和社会发展中起着举足轻重的作用。研究竹子PIF-like转座子的多样性,并克隆毛竹PIF-like转座酶的长片段,可为了解PIF-like转座子的转座机制打下基础。在以后的工作中,将研究PIF-like转座子在竹子生长发育过程中的作用,期望获得其是否与毛竹形态变异的分子机理相关的信息,使PIF-like转座子成为植物功能基因克隆和遗传转化的新工具。本文选取具有代表性的6个竹族,38个属中的44个竹种为材料,通过PCR扩增的方法,共获得139条PIF-like转座酶序列。这些序列的长度大多约为120aa,且大多为位于PIF -like转座酶的催化区域,但每个PIF-like转座酶片段均有差异。说明在竹种中的PIF-like转座酶明显具有多样性。同时,通过分析这139条PIF-like转座酶序列的碱基序列的多样性,根据数据得到:竹子转座酶碱基序列多样性丰富,且远缘种的核苷酸序列与来源于同一种或来源于近缘种的核苷酸序列相比,远缘种的核苷酸序列一致性更高。据此可推断:PIF -like转座酶是单起源且差异性大。这些结论可以通过下面的假定获得解释:在早期进化中,存在多样性古老世系转座酶,并且这些转座酶在竹子家族中通过垂直方式遗传。为了进一步阐明PIF -like转座酶的结构特性,本文再次以毛竹为材料,通过构建基因组文库和Southern Blotting筛选文库阳性克隆的方法,获得了三条与PIF -like转座酶相关的长片段序列,其中最长片段对应的氨基酸长度约为553aa。但遗憾的是这三条氨基酸序列不具有起始密码且因终止密码过多而不具转座活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 转座子的分类与特征
• 1.2 转座子的应用
• 1.2.1 转座子标签法
• 1.2.1.1 转座子标签法的优势
• 1.2.1.2 转座子标签法克隆基因的步骤
• 1.2.1.3 转座子标签法的应用
• 1.2.1.3.1 利用转座元件开发分子标记
• 1.2.1.3.2 利用转座子标签法克隆未知基因
• 1.2.2 利用转座子构建真核生物基因表达系统或载体
• 1.3 PIF 转座子的研究现状
• 1.4 本研究的目的与策略
• 2 竹子中 PIF-like 转座子多样性的初步研究和毛竹 PIF-like 转座子基因的克隆
• （一） 实验材料
• （二） 试剂
• （三） 仪器设备
• （四） 研究方法
• 1 竹子中 PIF-like 转座子多样性的初步研究
• 1.1 基因组 DNA 的提取
• 1.2 PCR 扩增 PIF-like 转座酶
• 1.2.1 PCR 引物的设计
• 1.2.2 PCR扩增及扩增后片段获取
• 1.2.3 连接与转化
• 1.2.3.1 感受态细胞制备
• 1.2.3.2 转化
• 1.3 质粒提取
• 1.4 测序
• 1.5 序列分析
• 2 毛竹PIF-like转座子长片段基因的克隆
• 2.1 基因组 DNA 的提取
• 2.2 基因组 DNA 的超声波处理
• 2.3 目的基因组片段的获取
• 2.3.1 探针设计
• 2.3.2 用磁珠法获取基因组片断
• 2.4 DNA 片段末端平滑化
• 2.5 载体制备
• 2.6 连接
• 2.7 转化
• 2.7.1 电转化感受态细胞的制备
• 2.7.2 转化
• 2.8 Southern blotting杂交
• 2.8.1 菌斑转移
• 2.8.2 菌斑固定
• 2.8.3 探针的标记
• 2.8.4 杂交与清洗
• 2.8.5 杂交信号的检测
• 2.9 质粒提取
• 2.10 测序与序列分析
• （五） 结果与分析
• 1 竹子中 PIF-like 转座子多样性的初步研究
• 1.1 基因组 DNA 提取的结果与分析
• 1.2 PCR扩增PIF-like转座子基因结果与分析
• 1.3 测序结果与序列分析
• 1.4 竹子PIF-like转座酶演化分析
• 1.5 竹子 PIF-like 转座酶多样性分析
• 2 毛竹 PIF-like 转座子长片段基因的克隆
• 2.1 毛竹总基因组制备和超声波处理后的结果与分析
• 2.2 质粒载体 Puc19 制备和处理后的结果与分析
• 2.3 连接的结果与分析
• 2.4 转化结果与分析
• 2.5 Southern Blotting烤膜和杂交时间结果与分析
• 2.6 southern杂交结果与分析
• 2.7 质粒提取结果与分析
• （六） 讨论
• 1 实验方法讨论
• 1.1 基因组 DNA 片段获取的讨论
• 1.2 插入片段的补平
• 1.3 载体去磷酸化的控制
• 1.4 电转化
• 2 实验结果讨论
• 2.1 竹子中 PIF-like 转座子多样性的初步研究结果讨论
• 2.2 毛竹 PIF-like 转座子基因克隆的结果讨论
• （七） 主要结论与展望
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢