论文摘要
目的:将本试验室构建的含生殖支原体黏附素（Mycoplasma genitalium adhesin protein ,MgPa）蛋白优势表位基因（MgPa’3 223～4 092bp）的重组表达载体pET-30a（+）/MgPa’在表达宿主菌E.coliRosettaTM2（DE3）中进行诱导表达,纯化表达产物并进行抗原性分析。应用杂交瘤技术,将SP2/0细胞与经重组蛋白MgPa’免疫的小鼠脾细胞进行融合,筛选抗重组蛋白MgPa’的单克隆抗体（mAb）,并进行鉴定和纯化。由此初步确定该mAb的应用价值,并为研制Mg感染诊断试剂盒奠定基础。方法:（1）采用镍亲和层析法纯化重组蛋白MgPa’,并用SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定表达产物。（2）以纯化复性后的MgPa’重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。（3）体内诱生腹水法制备抗体,ELISA法检测抗体效价,采用竞争法ELISA和Western-blot分析mAb的特异性,用mAb亚类测定试剂盒鉴定mAb的类别,用硫酸铵沉淀法对腹水中的mAb进行纯化。结果:重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下,表达了相对分子量（Mr）约为37kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA亲和层析法纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白;应用纯化复性后的重组蛋白MgPa’免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合;应用ELISA法筛选出了6株分泌抗MgPa’重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为12E7、4B1、6E3、2B8、6E2和10E2;竞争法ELISA或Western-blot分析结果显示mAb均能与重组蛋白MgPa’很好的结合。用腹水诱生法大量制备mAb;ELISA检测6株杂交瘤细胞诱生腹水中的mAb效价分别为1:25 600、1:25 600、1:12 800、1:25 600、1:25 600和1:25 600;经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit测定,6株杂交瘤细胞中12E7、4B1分泌的mAb为IgG2b,其它4株分泌的mAb均为IgG1。结论:（1）筛选出6株稳定分泌抗MgPa’mAb的杂交瘤细胞株,经鉴定6株杂交瘤细胞分泌的mAb均能识别重组MgPa’。（2）获得的抗重组MgPa’的mAb均为IgG类抗体,且能识别MgPa’抗原的天然表位,具有较好的特异性。