论文摘要
目的:恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。据世界卫生组织报告,全世界每年新发肿瘤病例约900万例,因肿瘤死亡者达700万人,且这一数字每年都有增加的趋势。所以,攻克癌症是摆在医务工作者面前的重大课题。在肿瘤的三大疗法中,药物治疗占重要地位。近50年的抗肿瘤药物研发工作使得肿瘤化疗取得了很大进步,特别是在恶性血液系统肿瘤治疗方面,患者的生存时间明显延长,但占恶性肿瘤90%以上的实体瘤治疗尚未取得满意疗效,仍有半数以上癌症患者对治疗无反应或产生耐药而最终导致治疗失败,而且合成药物在治疗中容易出现严重副作用。因此,发现并开发新型抗肿瘤药物仍然是医学界所面对的十分艰巨的使命与挑战。目前,针对肿瘤细胞内异常信号通路为靶点的特异性抗肿瘤药物的出现弥补了传统化疗药物的不足,这类药物只对肿瘤细胞具有杀伤作用,对正常细胞没有影响或影响较小。这种以细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗,亦称之为靶向治疗（targeted therapy）。该治疗方法要求找到肿瘤细胞中可能被抑制的靶点。随着分子肿瘤学、分子药理学的飞速发展,正在逐步阐明和揭示肿瘤发生发展的分子机制。已经阐明若干针对肿瘤细胞内异常信号通路的热点靶标,其中STAT3（Signal transducers and activators of transcription 3, STAT3）信号途径已被确认是多种人类肿瘤干预治疗的有效分子靶标。香加皮杠柳苷（Periplocin of Cortex Periplocae, CPP）是本实验室与华药合作研究工作中发现的具有抗肿瘤作用的天然抗肿瘤活性成分。同化学合成药物相比,天然活性物质往往具有结构新颖、活性高、不良反应小等特点而备受关注,也是制药工业研发具有我国自主知识产权药物的主要源泉。中药抗肿瘤作用机制复杂,往往是多环节、多途径、多靶点。CPP在发挥其抗肿瘤效应的过程中,有否对癌细胞内异常表达和活化的STAT3信号通路产生影响值得关注和探讨,这将为进一步阐明杠柳苷的抗肿瘤作用机制和开发其抗肿瘤效应,最终应用于临床奠定理论和实验基础。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在生物体细胞内,外源或内源性双链RNA（double stranded RNA, dsRNA）引起特异性基因序列沉默。该过程中长的双链RNA可被一种RNAaseⅢ类核酸内切酶Dicer酶识别和加工,成为2125nt的短双链RNA,即小分子干扰RNA（small interference, siRNA）。siRNA是RNAi过程中的效应分子,在细胞内RNA解旋酶作用下解链成正义链和反义链,反义链再与一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）形成复合体,即RNA诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex, RISC）,RISC通过siRNA的反义链识别并切割具有同源序列的mRNA,被切割后断裂的mRNA随即降解,从而导致特定基因沉默。理论上如果知道某种癌基因是肿瘤细胞所特有,可将针对该基因mRNA序列的siRNA导入靶细胞引起基因沉默,达到治疗肿瘤的目的。在肿瘤治疗领域的研究资料表明,针对肿瘤细胞内高表达的癌基因或者抗凋亡基因,使用siRNA特异剔除这些异常基因,可以抑制肿瘤的生长、杀死肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、增加放疗、化疗的敏感性,这种方法有望使恶性肿瘤在治疗学上取得重大突破。如果将CPP联合siRNA,使siRNA下调肿瘤细胞内过度激活的STAT3,能否提高CPP的抗肿瘤效应?CPP是否能够抑制STAT3信号通路?基于对上述的思考,本研究旨在①分析人肝癌细胞SMMC7721中STAT3的表达及酪氨酸磷酸化情况;②构建以STAT3为靶向的siRNA干扰重组质粒,沉默SMMC7721内STAT3基因的表达,并加以CPP药物干预,通过体内、体外实验,观察CPP及STAT3 siRNA抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的抗肿瘤效应及对STAT3信号通路的影响,深入揭示CPP及siRNA抗肿瘤作用的分子机制;③观察CPP与siRNA联合使用后是否产生更为显著的抗肿瘤效应,为新型肿瘤治疗策略的实施提供理论和实验依据。方法:1 STAT3在SMMC7721细胞内的表达分析应用Western blot、流式细胞术分析SMMC7721细胞中STAT3的表达及酪氨酸磷酸化情况。2靶向STAT3的siRNA重组质粒的构建与功能鉴定设计针对STAT3基因的三个特异性siRNA序列及无关序列HK-shRNA,体外合成编码siRNA的模板,将模板与线性化的质粒连接,连接产物转化感受态细菌DH5α,酶切鉴定重组质粒,并进行DNA测序鉴定。将重组质粒转染SMMC7721细胞48h后,激光共聚焦显微镜鉴定转染效率,应用Western blot、RT-PCR方法筛选最有效抑制STAT3表达的质粒表达载体用于后续实验。3 CPP及STAT3 siRNA诱导SMMC7721细胞凋亡的研究分五个实验组:A组:空白对照组,不采取任何干预措施,实验时于SMMC7721细胞中加入无血清的RPMI1640培养基进行培养;B组:HK质粒对照组,用Pgenesil-1- HK重组质粒转染SMMC7721细胞;C组:RNAi组,用Pgenesil-1-STAT3-1质粒转染SMMC7721细胞;D组:CPP处理组,于SMMC7721细胞中加入CPP,使其终浓度为2.5μg/ml（此浓度与预实验中所计算的IC50接近）;E组: RNAi+CPP组,于SMMC7721细胞中转染Pgenesil-1-STAT3-1质粒,同时加入CPP,使其终浓度为2.5μg/ml。转染48h后,MTT法测定不同处理组SMMC7721细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期和凋亡率;透射电镜观察细胞凋亡的超微结构。4 CPP及STAT3 siRNA对SMMC7721细胞STAT3信号通路的影响应用Western blot、RT-PCR检测上述不同处理组SMMC7721细胞STAT3信号通路相关分子的变化,包括上游分子JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3以及下游分子Survivin、Bcl-2、Bax。5 CPP及STAT3 siRNA对SMMC7721细胞荷瘤裸鼠抑瘤作用及对STAT3信号通路的影响用无血清RPMI1640液洗涤,并将SMMC7721细胞密度调至1×107/ml,在裸鼠右侧背部皮下接种SMMC7721细胞（0.2 ml含2×106个）,建立SMMC7721细胞荷瘤裸鼠模型,分为五个不同处理组,每组5只。A组:模型对照组,瘤内多点注射生理盐水,连续20d。B组:HK质粒对照组,瘤内多点注射HK质粒DNA,每2天注射1次,共10次。C组:RNAi组,瘤内多点注射Pgenesil-1-STAT3-1质粒,每2天注射1次,共10次。D组:CPP组,腹腔注射CPP（10mg/kg,1/d）,连续给药观察20d。E组: RNAi+CPP组,瘤内多点注射Pgenesil-1-STAT3-1质粒DNA,每2天注射1次,共10次;同时给予腹腔注射CPP（10mg/kg,1/d）,连续给药20d。观察裸鼠及肿瘤的生长情况,测定抑瘤率。处理20天后,摘取肿瘤组织,应用激光共聚焦显微镜观察质粒转染及表达情况,应用流式细胞术检测CPP及RNAi对肿瘤细胞周期和凋亡的影响;Western blot及免疫组化分析JAK1-STAT3信号通路中JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3的表达变化;免疫细胞化学法分析CD34的表达,以微血管密度MVD（microvessel density, MVD）来表示,MV（microvessel, MV）呈棕黄色。结果:1 SMMC7721细胞存在STAT3蛋白的表达,P-STAT3呈高表达,提示STAT3的异常表达和活化可能与人肝癌的发生有关。2经限制性内切酶SalI酶切鉴定分析,质粒表达载体Pgenesil-1-STAT3-1、Pgenesil-1-STAT3-2、Pgenesil-1-STAT3-3、Pgenesil-1-HK均符合设计要求。DNA测序结果表明,siRNA表达模板成功构建于Pgensil-1质粒载体上,序列完全正确,符合设计要求。重组质粒转染SMMC7721细胞48h后,激光共聚焦显微镜下可见转染的细胞由于表达绿色荧光蛋白而发出绿色荧光,未转染组的细胞没有荧光。转染STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3和HK的四个实验组SMMC7721细胞发出绿色荧光的细胞,分别占细胞总数的68%、70%、66%、65%,各组间表达强度无显著性差异（P>0.05）。未转染组及转染HK、STAT3-1、转染STAT3-2、转染STAT3-3五个实验组细胞中,STAT3 mRNA表达水平分别为0.906±0.081、0.891±0.101、0.302±0.083、0.596±0.112、0.603±0.057,转染STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3细胞中STAT3 mRNA表达水平均明显低于未转染组和转染HK组（P<0.05）,且以转染STAT3-1细胞STAT3 mRNA的表达最低,未转染组和转染HK组细胞中STAT3 mRNA表达水平无明显差异（P>0.05）。转染STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3组的的细胞STAT3 mRNA表达抑制率分别为66.10%、26.37%、21.21%。未转染组和转染HK、STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3五组细胞中STAT3蛋白表达水平分别为1.116±0.081、1.108±0.101、0.383±0.093、0.682±0.120、0.742±0.151,转染STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3细胞中STAT3蛋白表达水平均明显低于未转染组和转染HK组（P<0.05）,且以转染STAT3-1细胞中的STAT3蛋白表达水平最低,未转染组和转染HK组细胞STAT3蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）。转染STAT3-1、STAT3-2、STAT3-3组细胞的STAT3蛋白表达的抑制率分别为65.43%、38.45%、33.03%。RT-PCR和Western blot检测结果显示, Pgenesil-1-STAT3-1、Pgenesil-1-STAT3-2、Pgenesil-1-STAT3-3重组质粒均能下调SMMC7721细胞中STAT3 mRNA及蛋白的表达,且Pgenesil-1-STAT3-1比Pgenesil-1-STAT3-2、Pgenesil-1-STAT3-3具有更强的干扰效果。所以将Pgenesil-1-STAT3-1用于后续相关实验研究。3 CPP能明显抑制SMMC7721细胞的增殖,并呈浓度及时间依赖性,作用于SMMC7721细胞48h的IC50为（4.05±0.21）μg/ml。RNAi、CPP、RNAi+CPP作用不同时间（24h、48h、72h）后,SMMC7721细胞的增殖受到不同程度的抑制,抑制率随时间的延长而增强,与空白对照组比较均有显著性差异（P<0.05）,HK组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。RNAi+CPP组在不同的作用时间分别与RNAi组、CPP组比较有显著性差异（P<0.05）。提示SMMC7721细胞经过RNAi处理后能显著提高CPP对SMMC7721细胞增殖的抑制程度,两者有一定的协同效应。RNAi、CPP、RNAi+CPP作用48h后,SMMC7721细胞的G0/G1期细胞较对照组明显增多,S期和G2/M期细胞则显著减少,PI值显著下降,空白对照组相比有显著性差异（P<0.05）。其中RNAi+CPP组变化最为明显,G0/G1期细胞由对照组的（39.5±3.6）%升高至（80.6±3.3）%,S期和G2/M期细胞由对照组的（27.7±2.4）%和（32.8±2.5）%分别下降至（13.3±1.9）%和（6.1±2.0）%,提示CPP及RNAi均可将SMMC7721细胞阻滞于G0/G1期,CPP联合RNAi对SMMC7721细胞周期的阻滞作用更强。空白对照组和HK组之间无显著性差异（P>0.05）。流式细胞术分析结果显示,RNAi、CPP、RNAi+CPP作用48h后,SMMC7721细胞凋亡率均明显增高（P<0.05）,以RNAi+CPP处理组凋亡率为最高,由对照组的（4.10±1.50）%升高至（30.30±2.87）%,同时在G0/G1峰之前出现典型的亚二倍体凋亡峰。空白对照组和HK组之间无显著性差异（P>0.05）。透射电镜观察,RNAi、CPP、RNAi+CPP组SMMC7721细胞可见典型凋亡细胞超微结构变化,表现为细胞体积变小,细胞膜完整,细胞表面微绒毛和伪足减少或消失,胞浆凝缩,核内染色质凝聚呈新月状边集于核膜处,密度明显增高,界限清楚,内质网扩张,胞浆空泡化等特征性改变。4 CPP及RNAi能够影响SMMC7721细胞STAT3信号通路相关分子的表达。Western blot检测结果显示,各组细胞中JAK1的表达无显著性差异（P>0.05）;RNAi、CPP、RNAi+CPP组细胞的P-JAK1表达水平较空白对照组降低（P<0.05）,IOD比值由空白对照组的1.232±0.104分别下降至0.302±0.037、0.282±0.096,提示CPP可下调SMMC7721细胞JAK1的磷酸化水平;RNAi、RNAi+CPP组细胞STAT3表达显著降低（P<0.05）,IOD比值由空白对照组的1.114±0.154分别下降至0.406±0.051、0.379±0.051,提示靶向STAT3特异性RNAi可明显下调SMMC7721细胞STAT3蛋白表达;RNAi、CPP、RNAi+CPP组细胞P-STAT3表达水平显著降低（P<0.05）,IOD比值由空白对照组的0.891±0.165分别下降至0.307±0.032、0.457±0.104、0.201±0.087,提示RNAi及CPP共同作用于SMMC7721细胞时,STAT3磷酸化水平下降更为明显;HK组细胞JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3分子表达较空白对照组无明显改变（P>0.05）,说明插入无关序列重组质粒（HK）对STAT3通路相关分子的表达无干扰效应。RT-PCR及Western blot检测结果显示,RNAi、CPP、RNAi+CPP组SMMC7721细胞Survivin、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达较空白对照组显著下降,其中RNAi+CPP组下降更为明显（P<0.05）;Bax mRNA及蛋白的表达上升,RNAi+CPP组上升最为明显（P<0.05）;HK组Survivin、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达较空白对照组无明显改变（P>0.05）。提示CPP及RNAi干预后,Survivin、Bax、Bcl-2基因及蛋白均发生了变化。5模型对照和HK质粒对照组裸鼠的肿瘤持续增长,增长速度明显大于其它组;RNAi、CPP组裸鼠的肿瘤生长缓慢,而RNAi+CPP组瘤体较原来逐渐缩小。模型对照和HK质粒对照组荷瘤裸鼠的瘤重及肿瘤体积显著大于RNAi、CPP、RNAi+CPP组（P<0.05）;RNAi、CPP组肿瘤重量和体积明显大于RNAi+CPP组（P<0.05）;模型对照和HK质粒对照组之间无显著性差异（P>0.05）;RNAi、CPP组无显著性差异（P>0.05）。RNAi、CPP、RNAi+CPP组的抑瘤率分别为54.2%、49.6%、84.1%。CPP+RNAi组抑瘤率显著高于RNAi、CPP组（P<0.05）。激光共聚焦显微镜下观察,HK质粒对照、RNAi、RNAi+CPP组荷瘤裸鼠移植瘤组织中瘤细胞发出绿色荧光,说明质粒成功转染入瘤细胞内,而模型对照组、CPP组的裸鼠移植瘤未见绿色荧光。流式细胞仪分析结果显示,RNAi、CPP和RNAi+CPP组荷瘤裸鼠肿瘤中G0/G1期细胞明显增多,S期和G2/M期细胞明显减少,与对照组相比,均有显著性差异（P<0.05）,其中以RNAi+CPP组变化最明显。提示RNAi、CPP和RNAi+CPP处理均可将荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞周期阻滞于G0/G1期。RNAi、CPP和RNAi+CPP组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡率与对照组相比均显著增高（P<0.05）,并在G0/G1峰之前可见典型的亚二倍体凋亡峰,提示RNAi、CPP和RNAi+CPP处理均可诱导荷瘤裸鼠移植瘤组织细胞凋亡,而且以RNAi+CPP组的作用最为明显。Western blot检测结果显示,各组JAK1的表达水平均无显著性差异（P>0.05）;CPP和RNAi+CPP组移植瘤细胞P-JAK1的表达水平较模型对照组明显降低（P<0.05）。RNAi、RNAi+CPP组中SMMC7721移植瘤细胞STAT3的表达水平较模型对照组明显降低（P<0.05）;RNAi、CPP和RNAi+CPP组移植瘤细胞P-STAT3的表达水平较模型对照组明显降低（P<0.05）。HK质粒对照组中移植瘤细胞JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3较模型对照组无明显改变（P>0.05）。免疫细胞化学分析结果显示, RNAi、CPP、RNAi+CPP组MVD（microvessel density）分别为（8.9±2.2）/HP、（9.1±2.5）/HP、（4.7±1.8）/HP,较模型对照组（14.6±4.8）/HP明显下降（P<0.05）,RNAi+CPP组下降最为明显（P<0.05）。结论:1人肝癌细胞株SMMC7721存在STAT3蛋白的表达, P-STAT3呈高表达状态,提示STAT3的异常表达和活化可能与人肝癌的发生有关。2成功构建靶向STAT3的siRNA干扰重组体,筛选出抑制SMMC7721细胞STAT3表达效果最好的Pgenesil-1-STAT3-1质粒,为以STAT3为靶点的肝癌治疗后续实验研究奠定了基础。3 CPP和靶向STAT3的siRNA均能抑制SMMC7721细胞增殖并诱导细胞凋亡。与单用siRNA或CPP处理组比较,CPP联合STAT3 siRNA处理能够更为显著地抑制SMMC7721细胞增殖,使细胞凋亡率明显上升。4 SMMC7721细胞存在JAK1的表达和活化,STAT3 siRNA不能够抑制JAK1分子的表达和活化,CPP能够下调P-JAK1、P-STAT3的表达,而对JAK1和STAT3分子表达无影响。STAT3 siRNA及CPP能够调节STAT3的下游靶基因Survivin、Bcl-2、Bax的表达。STAT3 siRNA联合CPP对STAT3信号分子的抑制效果及调节其下游分子的效应更为明显。5 CPP及STAT3 siRNA均具有较强的体内抗肿瘤作用,二者联合体内抗肿瘤作用更为显著;CPP及STAT3 siRNA技术均能阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡;CPP能够下调SMMC7721细胞JAK1-STAT3信号通路中P-JAK1、P-STAT3分子的表达,RNAi能够下调SMMC7721细胞JAK1-STAT3信号通路中STAT3、P-STAT3分子的表达;STAT3 siRNA和CPP均能使反应血管生成能力的CD34表达降低;STAT3 siRNA和CPP联合使用对STAT3信号通路的抑制作用更强。