实验性糖尿病大鼠肺组织AGEs、CTGF、TGF-β1免疫组织化学观察及图像分析

论文摘要

目的：糖尿病（diabetes mellitus，DM）是多种因素引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，可导致全身多系统损害的一组临床综合征。长期以来，人们对DM心脏、肾脏、神经以及视网膜等并发症进行了深入细致的研究，而对DM肺脏并发症的研究相对较少。近年来，国内外对DM肺的研究更多的是围绕肺功能的降低，其病理和病理生理机制研究很少。在长期高血糖状态引起组织损伤的机制中，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）与DM多种慢性并发症的始动及发展有密切关系，被公认为是高糖毒性引起慢性组织损伤的重要原因之一，AGEs在DM患者肺中的变化未见报道。Ⅱ型肺泡上皮细胞及激活的成纤维细胞通过自分泌或旁分泌方式产生结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF），调节成纤维细胞的和细胞外基质9extracelluar matrix，ECM)的积聚，在肺纤维化进展中起重要作用。CTGF是一种新发现的致纤维化细胞因子，被视为转化生长因子-β1（transforminggrowth factor-β1，TGF-β1）的下游反应元件。TGF-β有4型，其中TGF-β1和CTGF共同在肺间质纤维化中起重要作用。二者均具有促进成纤维细胞增殖以及参与ECM的产生、积聚等功能。本研究用免疫组织化学方法，观察DM大鼠的肺组织AGEs、CTGF、TGF-β1的相关变化，来了解高糖毒性对肺组织的损害机制。方法：48只SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠随机分为两组：对照组和DM组，每组24只。链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）60mg／kg尾静脉注射制造DM动物模型，对照组尾静脉注射等量生理盐水，DM动物模型血糖值均大于16.65mmol／L，造模成功。对照组和DM组分别随机分为4周亚组、12周亚组、20周亚组，每亚组8只大鼠。造模成功后4、12、20周末，分别处死大鼠，留取大鼠的肺组织，10％（体积分数）福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。应用免疫组织化学方法观察DM肺组织中AGEs、CTGF、TGF-β1沉积的部位及其变化。采用图像分析软件型图像分析仪进行图像分析。结果：（1）造模成功后的DM大鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，体重下降，活动减弱，一般状态差。（2）AGEs免疫组化观察及图像分析显示：DM各亚组大鼠肺泡上皮细胞以及巨噬细胞，支气管粘膜上皮细胞，少量血管内皮细胞及平滑肌细胞可见大量阳性细胞，阳性细胞的平均灰度值低于相应阶段的对照组（P＜0.05），且随着DM病程的进展逐渐降低（P＜0.01）。对照组的大鼠肺泡巨噬细胞，支气管粘膜上皮细胞可见少量阳性细胞。（3）CTGF、TGF-β1免疫组化观察及图像分析显示：DM4周亚组大鼠的肺间质细胞、支气管粘膜上皮细胞，可见少量阳性细胞，对照组4周亚组的大鼠少数血管内皮细胞和少数气管粘膜上皮细胞、可见少量阳性细胞，两组间做比较，肺组织阳性细胞的平均灰度值无统计学差异：DM12、20周亚组大鼠的肺间质细胞、支气管粘膜上皮细胞可见大量阳性细胞，阳性细胞的平均灰度值低于相应阶段的对照组（P＜0.01）。DM组的各个亚组的大鼠的肺组织阳性细胞的平均灰度值随DM病程的进展逐渐降低（P＜0.01）。（4）Pearson相关分析显示：DM组的大鼠的肺组织AGEs与CTGF、TGF-β1之间正相关（γ=0.939、0.904；P＜0.01）。DM组CTGF与AGEs、TGF-β1正相关（γ=0.939、0.878；P＜0.01）。结论：（1）尾静脉一次注射STZ可以成功制备DM大鼠模型。（2）早期DM大鼠的肺组织中已存在AGEs的显著增多，随着DM病程的延长，逐渐显著增加，提示是高糖毒性作用的结果。（3）TGF-β1与CTGF均在中、晚期DM大鼠的肺组织中显著增加，与AGEs正相关，提示肺间质的变化可能与高糖毒性有关，有深入研究的必要。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验动物及模型的建立、分组
• 二、取材
• 三、主要试剂
• 四、主要仪器
• 五、免疫组织化学染色
• 六、结果判定及图像分析
• 七、统计学方法
• 结果
• 一、动物模型
• 二、免疫组织化学观察及图像分析结果
• 三、相关性分析
• 讨论
• 一、动物模型的建立
• 二、AGEs的产生和生物学功能
• 三、AGE参与DM慢性并发症的机制
• 四、AGEs在DM肺组织中的变化
• 五、CTGF的结构和生物学功能
• 六、TGF-β1的结构和主要生物学功能
• 七、CTGF与TGF-β1的关系
• 八、CTGF与TGF-β1在肺纤维化中的地位
• 九、CTGF与TGF-β1在DM肺组织中的变化
• 十、AGEs与CTGF、TGF-β1的关系
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢