蛭弧菌Bdh5221株理化特性和16Sr DNA序列分析及其在水产养殖中的运用研究

论文摘要

蛭弧菌是一种寄生性细菌,在自然条件下,除突变的宿主不依赖型蛭弧菌外（H-I）,其它的宿主依赖型（H-D）蛭弧菌生长和繁殖都需要宿主菌的存在,使得研究蛭弧菌的许多工作受到宿主菌的影响。本实验使用一株已经分离的海水蛭弧菌Bdh5221,在对其培养特性和噬菌谱研究的基础和排除其宿主菌的干扰下,研究其生理生化特性、16S rDNA序列以及在水产养殖中的运用,以期为水产动物疾病控制提供新的思路和方法。现分别报道如下:1.蛭弧菌Bdh5221理化特性和16S rDNA序列分析研究:利用蛭弧Bdh5221能在70℃30 min灭活的宿主菌上生长的特点,对其理化特性、药敏特性和16S rDNA序列进行了相关分析。结果表明:该株蛭弧菌为革兰氏阴性菌,呈杆状、弧状,一端有极长的极生鞭毛,细菌大小在0.2～0.5×0.6～1.5μm左右;生化实验表明:Bdh5221明胶穿刺试验和接触酶试验呈阳性,氧化酶反应呈阴性,对弧菌抑制剂O/129敏感;药敏实验表明:此菌对新霉素、卡那霉素、恩诺沙星敏感,对青霉素、磺胺嘧啶和万古霉素不敏感;对其16S rDNA序列的测定、分析表明,与其同源性最高的细菌是一株新发现的海洋新种细菌Kordiimonas gwangyangensis,同源性高达99%,而与其他蛭弧菌属细菌的同源性从90%到70%不等,并针对其基因序列作了相关进化分析。2.研究养殖水环境因子NO3--N、NO2--N、NE4+-N、PO43--p和S2--等主要水质因子对蛭弧菌海水菌株Bdh5221生长的影响,考察蛭弧菌Bdh5221在正常养殖水环境中的定植情况。结果发现:NO3--N添加浓度在0～10mg/L之间、NH4+-N添加浓度在0～5mg/L之间,随着浓度增高,NO3--N、NH4+-N对蛭弧菌Bdh5221的生长有一定的促进作用;NO2--N浓度添加在0～0.5mg/L之间,随着浓度增高,NO2--N对蛭弧菌Bdh5221的生长有一定的抑制作用;PO43--p浓度在0～10mg/L之间、S2--浓度在0～5mg/L之间,未见其对蛭弧菌Bdh5221的生长有影响。3.使用蛭弧菌Bdh5221作为饲料添加剂对银鲫投喂的实验:以0,104cfu/g,107cfu/g饲料的浓度将蛭弧菌Bdh5221菌液喷洒于基础料上投喂银鲫（Carassiusauratus gibelio）,于第7,14,21,28 d时检测鲫鱼肠道蛭弧菌数量的变化。在两个实验组蛭弧菌数量基本达到稳定（即28d）时,测定了蛭弧菌Bdh5221对银鲫肠道菌群和血清中非特异性指标的影响。结果显示:104cfu/g和107cfu/g添加组的大肠杆菌、气单胞菌数量明显少于对照组（P＜0.05）,而乳酸杆菌数量明显大于对照组（P＜0.01）,双歧杆菌数量有上升的趋势,拟杆菌变化不明显;非特性性免疫酶中除104cfu/g添加组的超氧化化物歧化酶变化不明显外,其余各实验组溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及酚氧化酶在104cfu/g和107cfu/g添加组中显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于对照组。由此表明在饲料中蛭弧菌有改善银鲫肠道菌群和提高免疫相关酶活性的作用。以上结果表明:蛭弧菌Bdh5221不仅噬菌谱广,在养殖水环境中易定植,还能在作为饲料添加剂使用时,优化银鲫肠道菌群的结构、提高银鲫机体的免疫酶活性,可以在生产中发挥其水体“活性抗生素”和优质微生态制剂的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 文献综述
• 1 蛭弧菌研究概况
• 1.1 蛭弧菌的分类地位
• 1.2 蛭弧菌的分布
• 1.3 蛭弧菌的生活周期
• 1.4 蛭弧菌的相关生理和理化特性
• 1.5 噬菌蛭弧菌生长影响因素
• 1.6 蛭弧菌在微生态的研究进展
• 2 本研究的目的和意义
• 第一章 蛭弧菌Bdh5221理化特性和16S rDNA序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验菌株
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 培养基及宿主菌悬液制备
• 1.4 培养特性观察
• 1.5 形态观察
• 1.6 生理生化指标的鉴定
• 1.7 药敏实验
• 1.8 细菌16S rDNA测定
• 1.9 序列分析及系统发育树的构建
• 2 结果
• 2.1 培养特性观察
• 2.2 形态观察
• 2.3 生理生化特征与药敏实验
• 2.4 不同分离方法对蛭弧菌分离效果研究
• 2.5 16S rDNA基因序列和系统发育学分析
• 3 讨论
• 3.1 该细菌的培养特性观察
• 3.2 生长特性的思考
• 3.3 生理生化特征和药敏结果的探讨
• 3.4 分离和确认蛭弧菌Bdh221 16S rDNA基因方法
• 3.5 16S rDNA基因与蛭弧菌属的差异的相关思考
• 第二章 养殖水体主要水质因子对蛭弧菌Bdh5221生长的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验用细菌
• 1.2 培养基
• 1.3 宿主菌悬液制备
• 1.4 试验设计
• 1.5 细菌计数
• 2 结果
• 3^--N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响'>2.1 NO₃^--N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响
• 2^--N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响'>2.2 NO₂^--N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响
• 4⁺-N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响'>2.3 NH₄⁺-N对蛭弧菌和宿主菌生长的影响
• 4^3--P对蛭弧菌和宿主菌生长的影响'>2.4 PO₄^3--P对蛭弧菌和宿主菌生长的影响
• 2-对蛭弧菌和宿主菌生长的影响'>2.5 S^2-对蛭弧菌和宿主菌生长的影响
• 3 讨论
• 第三章 蛭弧菌Bdh5221对银鲫肠道菌群和非特异性免疫指标的影响
• 1 试验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 实验鱼相关免疫酶的测定
• 1.4 统计分析
• 2 结果
• 2.1 实验使用饲料中蛭弧菌的稳定性
• 2.2 银鲫肠道蛭弧菌数量的变化
• 2.3 蛭弧菌Bdh5221对银鲫肠道菌群的影响
• 2.4 蛭弧菌Bdh5221对银鲫肠壁菌群的影响
• 2.5 蛭弧菌Bdh5221对银鲫血清免疫相关酶的影响
• 3 讨论
• 3.1 蛭弧菌在肠道定植部位和条件的研究
• 3.2 蛭弧菌对银鲫肠道肠道菌群的影响
• 3.3 免疫指标酶和肠道菌群变化的分析
• 结论
• 缩略语表
• 参考文献
• 致谢