新型高效抗微生物肽的优化设计与合成及其体内外抗多重耐药菌的研究

论文摘要

目的:各种耐药致病菌在全世界范围内的播散,使耐药致病菌感染所致疾病成为全人类共同的灾难。目前世界范围内细菌耐药的发展呈现出向多药耐药发展的趋势,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）,产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的细菌,以及多药耐药结核杆菌正在蔓延。更为严峻的是能够抵抗所有抗生素的全耐药细菌（pan resistant bacteria）已经出现,一旦人类感染这类细菌,可能会面临无药可治的境地。面对耐药细菌迅速蔓延、感染性疾病致死率持续攀高的严峻形势,控制耐药细菌感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点,寻找和研制有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物,已经成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。经典抗生素研发的主要策略之一是从已有各种类别抗生素中研发新的衍生物。伴随着抗生素的广泛应用,越来越多的细菌对现有抗生素产生交叉耐药,采用结构修饰和改造研发新型抗生素受到限制,找到新型抗生素的机会越来越少,抗生素研发速度明显减慢。而且这些新型抗生素应用于临床后,并未避免耐药性的产生,细菌很快对这些抗生素产生了新的耐药性。当前抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了研发新抗生素的速度。为了有效对抗日益严重的细菌耐药,必须寻找新的突破口。抗微生物肽不仅具有广谱的杀菌活性,而且在招募巨噬细胞和增强先天免疫系统作用中发挥中枢角色。最值得关注的是,抗微生物肽主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生杀菌活性,由于微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构,不易对抗微生物肽产生耐药性,因此抗微生物肽已经成为抗耐药菌研究中最具希望的新一代候选药物。抗微生物肽的研究中也存在着一些问题,主要表现在以下几个方面:第一,大多数抗微生物肽毒性高,对靶细胞的选择性低,易使红细胞膜破裂溶血。第二,大多数抗微生物肽不稳定,易被蛋白酶水解,体内半衰期短;许多在体外有明显抗菌活性的抗微生物肽,在生理盐浓度和血浆条件下活性丧失。第三,大多数抗微生物肽由20个以上氨基酸组成,生产成本高。针对上述问题,我们采取两种设计思路,即设计全新结构抗微生物肽和修饰改造已知结构抗微生物肽。利用计算机辅助设计上述两类抗微生物肽,并采用固相合成的方法加以合成。以当前临床感染中最常见、耐药发生率和耐药强度最高的七株致病菌为研究目标,观察所合成的抗微生物肽在体内、体外的抗菌活性,并对其作用机制进行深入的探讨,旨在从中筛选出高效、低毒、稳定、不易产生耐药性的新型抗微生物肽。方法:1.计算机辅助设计新型抗微生物肽:依据已知抗菌肽的理化性质和构效关系理论,采用全新设计和改造设计两种途径,分别设计出全新的N-末端连接不同长度脂肪酸链的抗微生物肽FA1、FA2、FA3、FA4、FA5、FA6;应用Accelrys/InsightII分子模型软件进行计算机辅助分析,根据昆虫来源抗菌肽thanatin的γ-核心模序结构,改造设计出抗微生物肽US1、US2、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10和DS1、DS2、DS3、DS4、DS6、DS7、DS8、DS9、DS10。对上述两类抗微生物肽的羧基末端进行酰胺化修饰,得到一系列C-末端酰胺化的多肽序列。2.新型抗微生物肽的合成、纯化与鉴定:以HOBt/DIC为缩合剂,在Rink树脂上,采用Fmoc保护α氨基酸,从C-端（羧基端）向N-端（氨基端）固相合成C-末端酰胺化的多肽链。先用MALDI-TOF质谱仪测定多肽粗品的分子量;再用RP-HPLC色谱仪对多肽粗品进行分离纯化;最后用ESI质谱仪测定多肽纯品的分子量。对于环化的多肽链,采用空气氧化的方法形成分子内二硫键。多肽氧化过程中,用反向高效液相色谱法（RP-HPLC）不断分析多肽氧化色谱峰与还原色谱峰面积的变化;监测多肽氧化的进程并对氧化后的多肽进行RP-HPLC纯化;最后用ESI质谱仪测定氧化前后多肽纯品的分子量。3.抗微生物肽体内外抗多重耐药菌药效学的研究:测定ESBLs-EC和MRSE的平板克隆形成单位（CFU）与光密度值（OD600）之间的关系;测定所设计的25条抗微生物肽对七株多重耐药菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）;通过测定ESBLs-EC和MRSE不同时间点的生长曲线,观察抗微生物肽DS1、US1和DS7对其生长的影响;通过平板克隆形成实验,计数ESBLs-EC和MRSE的菌落数（CFU）,观察抗微生物肽DS1、US1和DS7对其生长的抑制作用。通过溶血实验评估FA4、DS1、US1和DS7的溶血毒性;通过稳定性试验评估DS1和DS7在50%血浆中稳定性;通过耐药性试验分别评估ESBLs-EC对DS1和MRSE对DS7的耐药性。构建BALB/c小鼠的ESBLs-EC败血症模型和ICR小鼠的MRSE败血症模型,观察DS1对BALB/c小鼠和DS7对ICR小鼠生存时间、存活率的影响;通过测定BALB/c小鼠脏器内的CFU,观察DS1对BALB/c小鼠脏器内ESBLs-EC生长的抑制作用;通过BALB/c小鼠肺组织和脾组织的HE染色,观察DS1对BALB/c小鼠肺脏和脾脏的保护作用。4.抗微生物肽作用机制的研究:将DS1与ESBLs-EC,DS7与MRSE共同孵育不同时间（30、60、90 min）后,利用扫描电镜观察DS1对ESBLs-EC、DS7对MRSE表面形貌的影响。将6倍MIC浓度的DS1与ESBLs-EC,DS7与MRSE共孵育90 min后,利用透射电镜观察ESBLs-EC和MRSE菌体内超微结构的变化。用不同浓度（4、12、24μg/ml）的DS1与ESBLs-EC,DS7与MRSE孵育90 min后,利用荧光显微镜观察菌体内荧光的强度及其分布。结果:1.计算机辅助设计新型抗微生物肽:设计了6条N-末端连接不同长度脂肪酸的全新肽链,计算机辅助改造含γ-核心模序遗传标志的thanatin,设计了10条未形成二硫键的含γ-核心模序的多肽序列和9条形成二硫键的含γ-核心模序的多肽序列。2.抗微生物肽的合成、纯化与鉴定: MALDI-TOF质谱分析结果显示所合成抗微生物肽粗品的分子量的测定值与理论值相符;所有抗微生物多肽粗品经RP-HPLC纯化后,其纯度均达到95%以上;ESI-MS鉴定结果显示,多肽纯品分子量的测定值与理论值相符。在形成分子内二硫键的过程中,RP-HPLC分析显示,随着氧化时间的延长,多肽的氧化色谱峰面积逐渐变大,还原色谱峰面积逐渐变小;经RP-HPLC纯化后,所有环化多肽纯度均达到95%以上;ESI-MS鉴定结果显示,含有γ-核心模序的多肽链氧化前后的分子量相差2,与理论预测值相符。3.抗微生物肽体内外抗多重耐药菌药效学的研究:从19条含γ-核心模序的多肽中筛选获得3条具有抗菌活性抗菌肽,其中US1和DS1对阴性菌有明显的抗菌活性,且作用效果（MIC）相同;DS7对阳性菌有较好的抗菌活性,其中对MRSE作用最强。从6条含脂肪酸的多肽中筛选出4条肽链具有抗菌活性,其中含C16软酯酸的FA4活性最好。FA4、US1和DS1对9种菌的MBC均为2倍MIC,DS7对9种菌的MBC为≥2倍MIC。在2%和10%血浆中,FA4、DS1、US1和DS7在128μg/ml时均不引起溶血,它们的HC50远远高于阳性对照蜂毒素（melittin）。血浆稳定性实验结果表明:DS1和US1在血浆中代谢为活性更强的物质,DS7在血浆中十分稳定,而阳性对照药S4（1-16）在血浆中降解显著。ESBLs-EC和MRSE极易对抗生素产生耐药性,不易对DS1和DS7产生耐药性。DS1能够明显延长BALB/c小鼠的生存时间（p<0.01）,提高小鼠的生存率（p<0.01）;能够明显抑制BALB/c小鼠脏器内细菌的生长（p<0.01）;减轻ESBLs-EC对BALB/c小鼠肺脏和脾脏的损害。DS7能够延长ICR小鼠的生存时间（p<0.01）,提高ICR小鼠的生存率（p<0.01）。4.抗微生物肽作用机制的研究:扫描电镜下观察到,随着DS1和DS7作用时间的延长,ESBLs-EC和MRSE的水肿逐渐加剧,最终菌体破裂成不规则的小块。透射电镜下观察到,DS1作用后,ESBLs-EC细胞壁破坏严重,染色质丝及其它内容物漏出,细菌仅残留一个空壳。DS7作用后,MRSE出现异常的不均等分裂;菌体表面出芽现象增多;菌体内空泡增多、变大;细菌壁有破裂;菌体内出现带有环形螺纹的致密体。以PI（碘化丙啶）和SYTO 9分别作为红色和绿色荧光指示剂,显微镜下观察到,随着DS1药物浓度的增加,反映细菌膜破损的红色荧光逐渐增多,荧光强度逐渐增强;反映细菌膜完整的绿色荧光逐渐减少,荧光强度逐渐减弱;红色和绿色荧光都分别呈现出大聚集和小聚集现象。随着DS7药物浓度的增加,反映细菌膜破损程度的红色荧光的强度增加不明显。结论:1.通过全新和改造两种途径,设计并合成了一系列新型抗微生物肽,为抗微生物肽的设计和研究提供了新思路。2.通过体外药效学实验,筛选出抗微生物肽FA4、US1和DS7具有高效、低毒、稳定和不易产生耐药的优点,首次证实γ-核心模序中的二硫键不是抗菌肽发挥活性的必要条件。3.通过体内药效学实验,证明DS1和DS7能够分别延长败血症模型BALB/c小鼠和ICR小鼠的生存时间、并分别提高其生存率;DS1能有效抑制败血症模型BALB/c小鼠脏器内ESBLs-EC的生长、并抑制其对BALB/c小鼠肺脏和脾脏的损伤。4. DS1主要通过胞膜渗透作用杀灭细菌;DS7主要通过扰乱细菌正常分裂而抑制细菌生长。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 实验部分
• 第一部分 新型抗微生物肽的计算机辅助设计
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 抗微生物肽的合成、纯化与鉴定
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 抗微生物肽体内外抗多重耐药菌药效学的研究
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 抗微生物肽作用机制的研究
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 发表论著
• 致谢