黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究

论文题目: 黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 江明锋

导师: 张义正

关键词: 黄孢原毛平革菌,次生代谢,转录调控,分析,凝胶迁移率变动分析,抑制消减杂交,基因芯片,生物信息学

文献来源: 四川大学

发表年度: 2005

论文摘要: 黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）属于白腐担子真菌,是研究木质素生物降解的模式生物,该菌的基因组序列已由美国联合基因研究所测定完成。P.chrysosporium在进入次生代谢时产生2类依赖于H2O2的过氧化物酶—木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）,它们是降解木质素的主要酶类。早期的生理学研究表明,这2类酶的产生受营养因子、通氧量等因素影响。分子生物学研究表明,这两类酶均由基因家族编码,培养基中的氮、碳、热激、锰离子、分子氧等因素在转录水平上影响这些基因的表达,但其在次生代谢期间的转录调控机理仍然不清楚。阐明P.chrysosporium参与进入次生代谢过程中调控基因的表达规律不但有利于理解该菌的木质素降解机理,而且有利于利用这种真菌。本文就P.chrysosporium的次生代谢调控基因的克隆和表达展开了较系统的研究,取得了相应的研究结果。首先,用抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）和基因芯片（Microarray）技术研究了黄孢原毛平革菌在低氮培养基中培养48h和72h的基因表达谱。构建了含1728个72h和868个48h特异cDNA克隆的抑制消减文库;然后用巢式PCR法从中分别扩增出1555和767 EST片段;将它们点制成基因芯片。用反转录自mRNA的RT探针和来自于cDNA文库的SSH探针分别与芯片杂交。结果发现,SSH-探针与RT-探针的杂交结果有较大的差异,SSH-探针能与98.8%的斑点杂交,而RT-探针仅能与57.9%的斑点杂交。RT探针杂交结果的分析表明,在进入次生代谢的关键时间48h和72h期间,基因的表达有明显的差异。在48和72h文库中共鉴定出224个差异表达的基因片段。荧光定量RT-PCR分析表明,部分72h表达的基因具有十分明显的时间特异性。差异表达片段的T检验表明,72h和48h显著差异表达的基因分别有12和23个。测定的757个EST序列均可定位于P.chrysosporium基因组的145个不同的Scaffold上,其中部分EST序列可以被定位于2个以上的基因组位置上,暗示这些基因可能是基因家族。在72h特异序列中还发现了一些较为重要的基因:如芳香醇脱氢酶基因、热激蛋白基因、硫氧还蛋白基因等。在48h特异表达的片段中有

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第一章黄孢原毛平革菌代谢转换期基因表达研究

摘要

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 代谢阶段差异表达基因研究的总策略

3.2 P.chrysosporium mRNA的分离纯化

3.3 cDNA的SMART合成和RsaI酶切效果

3.4 抑制消差减杂交

3.5 抑制消减文库的构建

3.6 cDNA芯片制作与杂交

3.7 荧光定量PCR确定差异表达基因

3.8 差异片段的DNA序列分析

4 讨论

4.1 SSH结合Microarray技术可高效分析基因的表达差异

4.2 P.chrysosporium代谢阶段转换期的基因表达谱

4.3 新基因EST片段的发现

4.4 P.chrysosporium次生代谢期H_2O_2有关基因的表达

5 小结

参考文献

第二章黄孢原毛平革菌EST序列生物信息学分析

摘要

1 引言

2 EST序列分析系统的构建

2.1 硬件配置与Linux操作系统的安装

2.2 数据的获取与预处理

2.3 相关程序的获取与安装

2.4 EST载体序列的去除及Blast数据库的建立

2.5 数据处理过程及自动化实现

2.6 蛋白质三维模型构建和对该模型的分析

3 结果

3.1 EST的序列同源性分类结果及冗余序列的去除

3.2 EST序列的组装

3.3 基因的预测

3.4 SSH2330基因的蛋白三维结构和功能分析

3.5 基因家族的发现

3.6 具有不同的Poly(A)位点的基因

4 讨论

4.1 EST序列分析系统在处理SSH产生的EST片段中的必要性

4.2 基因预测的准确性问题

4.3 序列分析中发现的基因家族和其它信息

4.4 蛋白质三维结构的预测有助于新基因功能的分析

小结

参考文献

第三章黄孢原毛平革菌木质纤维素降解酶基因表达研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 总RNA的提取

3.2 RT-PCR引物的设计及验证

3.3 P.chrysosporium木质素降解系统相关基因的RT-PCR分析

4 讨论

4.1 营养因子对木质素过氧化物酶基因转录的影响

4.2 营养因子对其它木质纤维素降解相关基因表达的影响

4.3 lip、mnp、cbh1、glx基因在木片上生长时的基因表达模式

4.4 lip基因家族的组成形式与基因调控间的关系

4.5 木质素降解相关基因基因转录调控机制的研究方法

5 小结

参考文献

第四章黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因转录调控序列的鉴定

摘要

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 探针DNA片段的制备和放射性标记

3.2 黄孢原毛平革菌菌丝体总蛋白的提取

3.3 凝胶迁移率变动分析

4 讨论

4.1 丝状真菌基因5′顺式作用元件及其相应的转录因子的研究策略

4.2 lipA、lipC、lipF基因转录调控顺式作用元件的鉴定

5 小结

参考文献

文献综述

摘要

引言

1.木质素降解相关基因的分子生物学

1.1 lip基因家族

1.2 mnp基因基因家族

1.3 纤维素酶基因家族

1.4 H_2O_2产生有关的基因

1.5 P.chrysosporium中其它与木质素降解有关的基因

2.木质素降解相关基因的转录调控研究

2.1 C，N等营养因子对lip基因表达的影响

2.2 C，N，Mn~(2+)等营养因子对mnp基因表达的调控

2.3 C，N等营养因子对cbhⅠ和glx基因表达的调控

2.4 P.chrysosporium生长于天然木片时lip、mnp、cbhⅠ、glx基因表达模式

2.5 lip基因家族的组成形式与基因调控间的关系

2.6 C-AMP对木质素降解相关基因的表达调控

2.7 藜芦醇(VA)木质素降解中的作用

2.8 基因表达的时间特异性

3.P.chrysosporium木质素降解相关基因的异源表达

3.1 P.chrysosporium转化系统的建立

3.2 木质素降解酶的表达

4 P.chrysosporium的基因组计划

4.1 P.chrysosporium的基因组结构和特点

4.2 装配序列的总特征

4.3 P.chrysosporium中的蛋白家族和结构域

5.展望

参考文献

在读期间发表的论文

附表 Supplementary Table

Table1 72 SSHlibrary and Their Gene Model, Ratiao Kinds and Blast Homology in Genbank Database

Table2 48 SSHlibrary and Their Gene Model, Ratiao Kinds and Blast Homology in Genbank Database

Table3 Putative Function of ESTs, in the Homology Analysis with Phanerochaete chrysosporium

发布时间: 2005-10-08

参考文献

[1].黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）转化系统的建立及木质素酶cDNA的同源表达[D]. 李维.四川大学2000
[2].白腐真菌强化处理铅污染农业废物及其对铅的抗性机理研究[D]. 黄超.湖南大学2017
[3].白腐真菌细胞色素P450转化难降解有机物的功能研究[D]. 宁大亮.清华大学2009
[4].纳米银的环境毒理及其潜在的应用研究[D]. 郭志.湖南大学2017
[5].接种白腐真菌改善含铅农业固废微环境及其作用机理的研究[D]. 胡霜.湖南大学2011
[6].白腐真菌对废水中Pb2+的去除及稳定化机理的研究[D]. 李宁杰.湖南大学2015

黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究

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