猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及结构蛋白基因的克隆与序列分析

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的烈性传染病。在临床上主要表现为妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病等特征。该病最早于1987年报道于美国南部，现已遍及世界各地，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。尽管我国1995年才首次暴发此病，但根据临床和血清学调查，该病在我国普遍存在，而且近年来还呈流行态势。猪繁殖与呼吸综合征病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，依据基因序列分析，将PRRSV划分为两种基因型，即以LV株为代表的欧洲型和以VR2332株为代表的北美洲型。同其它有囊膜的RNA病毒一样，PRRSV基因存在高度的变异性，PRRSV的同型毒株之间基因nt序列存在不同程度差异，而欧美洲型毒株之间差异更大。近年来分离的PRRSV的序列和抗原分析发现，不同分离株间在毒力、基因序列和抗原性方面都存在着较大的变化。为此，本研究从临床发病猪采集病料，进行了病毒的分离鉴定，并成功分离到一株PRRSV，对其结构蛋白基因进行克隆、测序及遗传进化分析，以期找出该分离株与其它流行株及疫苗株间的亲缘关系及遗传进化规律，为PRRS的流行病学调查及PRRS的致病机制的研究奠定基础。具体内容如下：1、PRRSV的分离鉴定将从黄石一发病猪场的病猪血清和肺脏经处理后接种MARC-145细胞，结果血清接种细胞没有出现病变，而肺脏接种细胞在盲传第二代时出现了PRRSV所致的特征性病变。而用同样的血清和病料接种的BHK-21、PK-15和IBRS-2细胞均没有病变，盲传3代后，也同样没有出现病变。这与PRRSV能在MARC-145细胞上增殖，但不能在BHK-21、PK-15和IBRS-2上增殖是一致的。将分离得到的病毒在MARC-145细胞上传代得到的上扩大培养后测定TCID50为10-3.61／0.1mL。用本室自制的PRRSV、PRV、FMDV、HCV、PPV和JEV阳性血清，对分离毒株进行中和试验，结果所分离的病毒只能被美洲型PRRSV阳性血清所中和，不能被PRV、FMDV、HCV、PPV和JEV阳性血清所中和。将获得的病毒经非线性蔗糖密度梯度离心，分别收集各梯度区带上的蛋白提取物，并进行负染，在电子显微镜下观察。结果在35％与45％蔗糖之间收集的条带观察到大小约为50～60nm的病毒粒子，有囊膜，呈球形。其大小及形态与PRRSV一致，这进一步也证实了所分离的病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒，将其命名为PRRSV HS株。2、HS结构蛋白基因的克隆、测序及序列分析利用RT-PCR扩增出HS株各结构蛋白基因的cDNA片段，将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNAMAN软件，将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株（VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV）的相应基因进行序列比较，并将推导氨基酸序列进行同源性比较和遗传变异分析，绘制系统发育树。结果表明，HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6％—99.7％，与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9％—49％；推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6—99.6％，与LV株的同源性为54.2％—78.2％。系统发育树表明，HS株属于美洲型，与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系最近。从推导的氨基酸序列比对可见，HS株的结构蛋白均不同程度的出现变异，主要表现为在ORF2a中，由W47→47R，1118→V118；ORF3中，D86→R86，S122→L122；ORF4中，S51→R51；在ORF5中，L28→P28，L50→P50，A113→V113。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征及历史
• 1.2 PRRS的危害及流行病学特点
• 1.2.1 PRRS的危害
• 1.2.2 PRRS的流行病学
• 1.3 PRRS的病原特性
• 1.3.1 PRRSV的分类
• 1.3.2 PRRSV理化特性
• 1.3.3 PRRSV的抗原性
• 1.3.4 PRRSV的细胞增殖特性
• 1.3.5 PRRSV的致病机理
• 1.4 PRRSV分子生物学特征
• 1.4.1 抗体依赖性增强作用
• 1.4.2 PRRSV持续感染
• 1.4.3 PRRSV的基因组变异和RNA重组
• 1.4.4 PRRSV的抗原性变异
• 1.4.5 PRRSV的毒力变异
• 1.4.6 PRRSV的准种
• 1.5.PRRSV分子生物学研究进展
• 1.5.1 PRRSV基因组的结构与功能
• 1.5.2 PRRSV的蛋白质
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞与菌珠
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 主要药品与试剂盒
• 3.1.4 主要培养基及其配制
• 3.1.5 缓冲液
• 3.1.6 本实验所用的引物与扩增条件
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 病料采集与处理
• 3.2.2 细胞的培养
• 3.2.3 病毒的分离
• 50的测定'>3.2.4 TCID₅₀的测定
• 3.2.5 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
• 3.2.6 电镜观察（负染法）
• 3.2.7 PRRSV基因组RNA的提取
• 3.2.8 RT-PCR扩增与检测
• 3.2.9 PCR与酶切产物的回收与纯化
• 3.2.10 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.12 连接产物的转化
• 3.2.13 质粒的小量制备（改良的碱裂解法）
• 3.2.14 质粒的大量制备
• 3.2.15 阳性克隆质粒的酶切鉴定
• 3.2.16 序列分析
• 第4章 结果与分析
• 4.1 病料接种后细胞病变
• 50的测定结果'>4.2 所分离病毒的TCID₅₀的测定结果
• 4.3 中和试验结果
• 4.4 电镜观察结果
• 4.5 HS结构蛋白基因的扩增与克隆
• 4.6 核苷酸同源性分析
• 4.7 氨基酸同源性分析
• 4.8 核苷酸进化树绘制
• 第5章 讨论与结论
• 5.1讨论
• 5.1.1 病毒的分离鉴定
• 5.1.2 PRRSV的遗传变异分析
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢