论文摘要
目的:A族溶血性链球菌（GAS）是咽部、皮肤、软组织感染的常见致病菌,也是引起儿童中毒性疾病猩红热、毒性休克综合征等的病原,它的危害还在于可以导致感染后的自身免疫性疾病风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎、牛皮癣以及免疫性脑病等。由于耐药菌株的出现及链球菌本身的免疫逃逸,临床上链球菌感染仍然存在着反复性及难以治愈等问题,疫苗有望成为控制链球菌感染的最有效措施。尽管研究链球菌疫苗的历史可以追溯至四十年前,但各种原因导致目前仍没有理想的疫苗问世。M蛋白由于血清型众多及其与人的心脏、肾脏等发生交叉免疫反应,因此其应用受到限制。除此以外,寻求非M蛋白疫苗的脚步也没有停止。世界各地不同实验室的研究涉及到链球菌的F1蛋白、Sse蛋白、C5肽酶、链球菌糖、外毒素等,但免疫效果始终难以超越M蛋白,因此非M蛋白与M蛋白的联合构建也是一种趋势。Fba蛋白（Fibronectin-binding protein a）是2001年由Terao等发现的一种新的链球菌表面蛋白,它与金黄色葡萄球菌Fn结合蛋白（FnBPA）同源性高达69%,其基因被定为Spy2009。经测定该基因含有1068个核苷酸,编码355个氨基酸,分子量为37.8Kda。整个肽链从N端分为信号肽区,双螺旋结构区,富含脯氨酸区及C端的锚定区。它存在于链球菌的M1、2、4、9、13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等多个血清型中,各型之间的Fba蛋白差异不大。实验结果显示表达Fba蛋白的GAS（Fba+ GAS）侵入上皮细胞的能力较强。它还可以结合补体调节蛋白FH和FHL-1,并可能借此逃避补体攻击、抵抗巨噬细胞的调理吞噬。本室前期研究发现Fba蛋白可诱发与M蛋白相当的保护性免疫应答,因此Fba蛋白具备作为GAS疫苗候选蛋白的极其有利的潜质。本研究旨在研制抗Fba蛋白的单克隆抗体,根据Fba蛋白的结构进行分段克隆表达,并对获得的单克隆抗体结合区域进行初步鉴定,为进一步研究Fba蛋白功能及研制其表位肽疫苗奠定基础。方法:1将GST-Fba重组蛋白联合佐剂免疫雌性BALB/c小鼠。以GST-Fba重组蛋白为包被抗原,采用间接ELISA方法检测小鼠抗血清效价。取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经HAT培养基选择培养,间接ELISA法筛选阳性克隆,有限稀释法进行克隆化,获得稳定分泌抗A族链球菌表面Fba蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,接种小鼠腹腔制备腹水。2鉴定单克隆抗体。以重组的GST-Fba蛋白为抗原包被,采用间接ELISA法测定腹水及上清单克隆抗体效价,免疫印迹分析单克隆抗体特异性,采用全菌ELISA鉴定单克隆抗体的抗原表位是否为位于菌体表面的天然表位。3根据Fba蛋白的结构特点将其划分为四个重叠区域,划分结果为:37110aa、68161aa、104277aa、160324aa。分别命名为FbaA1、FbaA2、FbaA3、FbaA4。4 PCR方法扩增分段fba基因,PCR产物克隆至原核表达质粒pGEX-2T,测序正确后将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导分段重组蛋白的表达,SDS-PAGE电泳观察结果,Western- blotting鉴定。亲和层析柱纯化重组蛋白。5免疫印迹法、ELISA法鉴定单克隆抗体与四段蛋白的结合区段。6在线预测Fba蛋白的B细胞表位。结果:1经3次亚克隆后获得两株稳定分泌抗GST-Fba融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。分别命名为1号单抗、2号单抗。融合率为37.1%,GST和GST-Fba蛋白双筛阳性克隆率为2%。2杂交瘤细胞培养上清抗体最高效价达1:640,腹水抗体最高效价达1:105。免疫印迹法显示单克隆抗体与GST-Fba融合蛋白有特异性反应带,与GST则未见有反应条带。全菌ELISA结果显示所得的1号单抗和Fba+及Fba-菌的结合力无明显的区别,说明此单抗所针对的表位不位于菌体表面,或并非Fba蛋白的天然表位,也可能与非Fba蛋白存在着交叉反应。2号单抗显示其可以特异的结合Fba+菌,和Fba-菌的结合能力极弱,表明2号单抗结合的表位为位于菌体表面的Fba特异的天然线性表位。3 PCR扩增产物大小约242bp、302bp、540bp、512bp与理论值相附。4表达的重组菌经SDS-PAGE分析出现四条强的诱导表达带,未经诱导的重组菌此处的蛋白带较弱。免疫印迹分析显示表达的该重组蛋白能被抗GST的单克隆抗体识别,说明重组菌表达了Fba的分段融合蛋白。5单抗与表达的四段蛋白的免疫印迹法鉴定结果显示1号单抗结合FbaA3及FbaA4段,2号单抗仅仅结合FbaA2段。ELISA法结果显示与免疫印迹法鉴定结果相一致。2号单抗仅结合FbaA2段,与FbaA1及FbaA3段不结合,其结合的表位可能位于104-110aa左右。6实验结果与在线预测B细胞表位结果相符。结论:1本研究通过常规细胞融合,成功筛选出2株针对Fba蛋白杂交瘤细胞株,并证明了该单抗的生物学活性,为深入研究GAS的致病机制提供了有力的工具。2成功克隆、表达了Fba分段蛋白,初步鉴定出两株单抗的结合区域,为进一步研究Fba蛋白的功能,确定Fba蛋白表位及表位疫苗的研制奠定了基础。
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