论文摘要
气道重塑是支气管哮喘的重要病理特征之一,在哮喘发病过程中起重要的作用。气道重塑过程中平滑肌细胞增生、肥大,成纤维细胞活化,并且分化为特异性表达a-平滑肌动蛋白（smooth muscle a-actin, a-SMA）的肌纤维细胞,a-SMA目前被认为是早期气道重塑中重要的指标。肺间质纤维化的过程中,发生了气道炎症与肺纤维化的病理改变,这与哮喘发生过程中的气道炎症和气道重塑过程中纤维化为相似的病理改变,据此可以推断：在肺间质纤维化发病过程中的发挥重要作用的某些炎症因子,在哮喘的发病过程中可能同样发挥重要作用。发现于炎症区分子1（found in inflammatory zone 1, FIZZ1）又名类抵抗素因子（Resistin-like molecule-a, RELM-a）是2000年首次在过敏性炎症中发现的独立新基因。NOTCH1是一种单次跨膜受体蛋白,可影响多种细胞的分化、增殖和凋亡。近期研究显示在肺成纤维化过程中二者均可促进肌纤维细胞的分化,而且两者的作用机制存在密切的联系。但二者在支气管哮喘的发生中是否发挥作用,作用机制及相关性还了解甚少。有研究表明噻唑烷二酮（TZD）类药物如罗格列酮可抑抵抗素的表达。本实验中通过建立哮喘模型,研究FIZZ1及NOTCH1在哮喘大鼠肺内的表达以及在气道重塑发生过程中的作用,并应用罗格列酮进行干预,以期为哮喘的早期干预以及治疗提供理论依据。目的本实验中通过检测支气管哮喘模型大鼠肺组织中a-SMA蛋白及FIZZ1基因,NOTCH1基因表达,探讨FIZZ1及NOTCH1在支气管哮喘气道重塑过程中的作用,以及罗格列酮对气道重塑的干预作用,旨在为阐明支气管哮喘复杂的发病机制及治疗寻找一种新的研究方向。材料和方法1动物分组及模型制作方法雄性SDF级大鼠45只随机分为哮喘组、干预组及对照组,每组15只。哮喘组用10%卵清蛋白（ovalbumin, OVA）混悬液通过双侧腹股沟及皮下注射致敏,用2%OVA雾化吸入激发。干预组致敏和激发同哮喘组,于雾化第七天开始给予罗格列酮灌胃共七天。对照组用生理盐水双侧腹股沟、腹腔注射及雾化吸入,剂量及时间同哮喘组。2标本留取各组大鼠于末次雾化结束后24小时内麻醉后开胸取左肺,置于负80°冰箱中冻存,以备作逆转录-多聚酶链反应用。然后迅速经右心室插管至肺动脉,注入生理盐水冲洗大鼠肺组织,至肺组织变白后摘取右肺中叶,并将肺组织放置固定于4%的甲醛溶液,石蜡包埋,切片,分别做HE染色和免疫组织化学染色。3免疫组化及HE染色结果分析对于HE染色图片,观察各组病理改变。对于免疫组化图片结果,测定阳性区平均光密度值。4 RT-PCR观察肺组织FIZZ1mRNA及NOTCH1mRNA的表达提取冻存的大鼠左肺的总RNA,并逆转录为cDNA,设计引物扩增目的片段FIZZ1、NOTCH1与GAPDH（内参）。将扩增产物进行电泳,并测定FIZZ1、NOTCH1与GAPDH的灰度值。5统计学分析应用SPSS17.0对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析对各组样本均数进行比较,各因素之间的相关性采用pearson相关分析,以α=0.05为检验水准。结果1 HE染色结果哮喘组大鼠气道出现气道壁增厚,气道上皮细胞脱落,管腔变形狭窄,黏液分泌明显增多,平滑肌层显著增厚,杯状细胞化生明显,气管周围炎性细胞显著浸润等病理改变。干预组上述病理改变轻于哮喘组。对照组肺组织结构无明显改变。2免疫组化结果哮喘组支气管壁上可见大量被染成褐色的a-SMA的阳性反应信号,罗格列酮干预组被染成褐色的a-SMA的阳性反应信号表达较哮喘组少,而对照组a-SMA的表达较弱。3 RT-PCR的结果FIZZ1mRNA及NOTCH1mRNA在哮喘组及干预组的表达高于对照组（P<0.05）,其中干预组低于哮喘组（P<0.05）,具有统计学意义。4 a-SMA与FIZZ1mRNA的相关性肺组织内FIZZ1mRNA的表达强度与肺组织中a-SMA表达量呈正相关。5 a-SMA与NOTCH1mRNA的相关性肺组织内NOTCH1mRNA的表达强度与肺组织中a-SMA表达量呈正相关。6 FIZZ1mRNA与NOTCH1mRNA的相关性肺组织内FIZZ1mRNA的表达强度与NOTCH1mRNA表达强度成正相关。结论1 FIZZ1和NOTCH1是引起哮喘气道重塑的重要炎症因子,且在促使哮喘气道重塑的发生过程中有协同作用。2罗格列酮可改善哮喘气道重塑。