双光子核酸分子光开关MVEC体外细胞毒性的研究

论文摘要

核酸分子光开关（molecular light switch），是一种重要的染色体探测剂，作为一种光开关分子，结合到DNA后，其荧光信号会显著增强，这样与光开关分子结合后的染色体在暗背景下会发出很亮的荧光，而未结合光开关分子的染色体则不能突显于生物组织。这对于显示活细胞中的染色体非常实用。当这种分子光开关兼有双光子吸收特性时，它对生物标本在荧光显微成像方面将会产生重要的意义。山东大学晶体所以9-乙基咔唑为母体，新设计、合成了含有阳离子和N-基团的两种化合物分子MVEC和BMVEC。这两种咔唑中的N原子均被烷基化，增强了两种分子的双光子吸收特性，是一种新型的双链DNA（double strand DNA，dsDNA）分子光开关。通过研究他们与DNA结合后的荧光强度和最大峰位置可以推测出DNA的一些结构信息，所以这种染料具有很好的应用前景。MVEC能够穿过细胞膜、进入活体细胞，并与dsDNA结合而发出强烈的蓝色荧光，在荧光显微镜下就能进行观察。从理论上讲，MVEC对于活细胞染色体的研究能够起到非常重要的作用。但作为活体染料，不但要能使活体状态下的细胞或组织特异性着色，而且要求对活细胞无毒性或毒性极小，不影响细胞的生命活动，同时不会产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。因而，对于其细胞毒性等生物学特性的研究便成为目前的首要任务。MVEC是否具有细胞毒性、以及其剂量和毒性效应是何种关系是目前MVEC广泛应用前要解决的主要问题。有关这些问题的研究目前未见有文献报道。本文通过对MVEC细胞毒性的初步研究，为这种染料的广泛应用提供基础实验依据。本论文的研究目的是研究dsDNA分子光开关MVEC的染色特性及对Hela细胞（人宫颈癌细胞）及Lewis细胞（小鼠肺癌细胞）的增殖抑制毒性和凋亡诱导作用，并探讨其作用机制。研究方法是通过应用激光共聚焦扫描显微镜观察MVEC在细胞中的准确定位；通过MTT比色法测定标记细胞与未标记细胞的增殖情况，据此判断该染料是否具有细胞毒性，以及毒性效应与剂量、时间的关系；通过流式细胞术Annexin V／PI双染色法和琼脂糖凝胶电泳法，观察MVEC处理hela细胞后凋亡相关指标的变化。本实验取得了以下几个有意义的结果：1、MVEC具有细胞生长抑制作用，并且抑制作用随着浓度的增加而增强；细胞生长抑制毒性效应呈现剂量依赖关系。2、证实了MVEC引起的细胞毒性是由于诱导了细胞早期凋亡而引起的。随着MVEC药物浓度的增加和作用时间的延长，发生凋亡的细胞比例也显著增加，而且经琼脂糖凝胶电泳检测到了典型的DNA ladder。3、确定了该染料的最佳染色时间和染色浓度。保证MVEC在该浓度下对细胞染色时毒性达到最低，使该染料的应用范围能够得到更大限度的拓展，比如可用于细胞增殖实验；细胞分裂周期的估算；细胞移植的体内检测等。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 缩略词表
• 前言
• 1 核酸荧光染料的研究与应用
• 2 双光子核酸荧光染料的特性
• 3 咔唑类化合物细胞毒性的研究进展
• 4 本论文研究的内容及意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 MTT比色分析法进行MVCE细胞生长抑制实验
• 2.2 MVEC在细胞中的定位
• 2.3 用流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带
• 2.5 LSCM观察细胞凋亡
• 2.6 统计学分析
• 结果
• 1 荧光染料MVEC在细胞中的定位
• 2 MVEC对Hela细胞吸光度和细胞存活率的影响
• 3 MVEC对lewis细胞的生长抑制作用
• 4 MVEC诱导的细胞凋亡
• 4.1 流式细胞仪检测结果（FITC-Anenxin V/PI检测法）
• 4.2 倒置显微镜及LCSM观察MVEC诱导的活体细胞的凋亡
• 4.2.1 倒置显微镜观察细胞生长情况
• 4.2.2 LSCM观察细胞凋亡
• 4.3 琼脂糖凝胶电泳结果
• 讨论
• 1 MVEC的最佳染色时间和染色浓度
• 2 MVEC具有细胞生长抑制作用
• 3 MVEC引起的细胞毒性是由于导致细胞早期凋亡而引起的
• 小节
• 参考文献
• 致谢