猪白细胞介素4基因克隆、表达及佐剂效应的研究

论文摘要

根据GenBank 上已登录的猪IL-4 基因（AY294020）、利用PrimerSelect 软件和Oligo5.0 软件设计了引物,用植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）共同刺激分离的猪外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用反转录PCR（RT-PCR）技术扩增猪IL-4 基因,将扩增到的基因与pGEM-T-easy 载体连接、转化后,经蓝白斑筛选、酶切、PCR 及测序鉴定;然后设计含酶切位点的表达引物,以重组质粒pGEM-T-IL-4 为模板进行扩增,所扩产物与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.1 连接,构建原核、真核重组表达质粒;用ITPG分别在32℃和28℃条件下诱导重组原核表达载体,并提取不同诱导温度下的蛋白,并对表达的蛋白分别用Sephadex G-200 层析柱、GST柱进行纯化、然后用MTT法检测其生物学活性。真核表达质粒提取纯化后与TSO18、猪囊虫全虫疫苗联合佐剂免疫猪,用ELISA法检测抗体。本实验中成功的克隆的猪IL-4 基因,用序列分析软件分析:该序列与参考序列IL-4基因核苷酸序列同源性为99%,氨基酸的同源性为97.8%,其包括一个完整的阅读框,大小为402bp,编码134 个氨基酸;与其它猪种IL-4 基因阅读框比较显示同一物种间基因的保守性很强。研究中成功的构建了猪pGEX-4T-1-IL-4、pcDNA3.1-IL-4 表达质粒。SDS-PAGE结果显示重组原核表达质粒在两种温度都表达分子量为38KD左右蛋白,与预测的相一致;在32℃目的蛋白主要以包涵体表达,表达产物约占菌体总蛋白的30%;在28℃时可表达部分可溶性蛋白。用MTT检测结果表明这两种蛋白都能够促进淋巴细胞的增殖分化,证明纯化后的蛋白具有生物学活性;真核表达质粒免疫猪抗体滴度明显高于各对照组,说明猪IL-4 基因重组真核表达载体对猪囊虫全虫疫苗有良好的免疫佐剂作用,优于传统使用的206 佐剂。这为为研制新型的高效免疫佐剂和生物制剂奠定基础。

论文目录

• 第一部分 文献综述
• 1 前言
• 2 国内外的研究现状
• 2.1 细胞因子的研究现状
• 2.2 白细胞介素4的研究现状
• 2.2.1 IL-4的产生及结构和特点
• 2.2.2 IL-4的作用机制
• 2.2.3 IL-4的生物学功能
• 2.2.4 IL-4的应用
• 2.2.4.1 在疾病诊断与治疗方面的应用
• 2.2.4.2 在疫苗佐剂中的应用
• 2.2.5 生物学活性的测定
• 3 研究的目的和意义
• 第二部分 实验研究
• 实验一 IL-4基因的克隆鉴定、与序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物、菌种和载体
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 溶液
• 1.1.5 仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PBMC诱导剂的选择
• 1.2.2 淋巴细胞的分离与培养
• 1.2.3 淋巴细胞的刺激诱导
• 1.2.4 总RNA的提取
• 1.2.5 RT-PCR扩增目的片段
• 1.2.5.1 引物的设计策略
• 1.2.5.2 引物的设计与合成
• 1.2.5.3 RT-PCR扩增
• 1.2.5.4 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.6 目的基因的克隆
• 1.2.6.1 PCR产物与pGEM-Teasy载体的连接
• 1.2.6.2 感受态细胞的制备
• 1.2.6.3 连接产物的转化
• 1.2.7 重组质粒的提取与鉴定
• 1.2.7.1 用碱裂解法小量提取重组质粒
• 1.2.7.2 重组质粒的鉴定
• 2 实验结果
• 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化
• 2.2 RNA提取结果
• 2.3 RT-PCR产物
• 2.4 重组质粒的鉴定
• 2.5 猪IL-4基因序列分析
• 3 讨论
• 实验二 原核表达及蛋白活性的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 表达载体的构建与鉴定
• 1.3.1 表达引物的设计
• 1.3.2 重组表达质粒的构建
• 1.3.2.1 目的片段的扩增
• 1.3.2.2 目的片段与pGEX-4T-1载体的酶切回收
• 1.3.2.3 目的片段与表达载体的连接转化
• 1.3.2.4 重组表达质粒的提取与鉴定
• 1.3.2.5 组质粒的诱导表达
• 1.4 表达产物的检测
• 1.5 蛋白质的纯化
• 1.5.1 包涵体形式重组蛋白的收集与处理
• 1.5.2 包涵体的溶解
• 1.5.3 硫酸铵沉淀法浓缩蛋白
• 1.5.4 透析溶解的蛋白质
• 1.5.5 蛋白的纯化
• 1.6 可溶性形式重组蛋白的表达提取
• 1.6.1 可溶性形式重组蛋白的表达
• 1.6.2 按照GST纯化试剂盒说明纯化
• 1.7 重组蛋白生物活性分析
• 2 实验结果
• 2.1 重组表达质粒的鉴定
• 2.3 重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析
• 2.4 蛋白纯化效果的结果
• 2.5 重组融合蛋白生物学活性分析
• 3 讨论
• 实验三 猪IL-4真核表达载体的构建及免疫佐剂效应研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物、菌种和载体
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 培养基及溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 猪IL-4真核表达载体的构建、转化及鉴定
• 1.2.3 重组真核表达载体质粒提取及纯化
• 1.2.3.1 质粒大批量提取
• 1.2.3.2 质粒DNA的纯化
• 1.2.3.3 抗原的制备
• 1.2.4 重组IL-4真核表达质粒疫苗佐剂试验
• 1.2.4.1 家猪的免疫程序
• 1.2.4.2 猪抗TSO18抗体动态水平检测
• 2 结果
• 2.1 猪IL-4真核表达载体的构建
• 2.2 重组真核表达载体质粒提取及纯化
• 2.3 重组IL-4真核质粒免疫佐剂效应
• 3 讨论
• 第三部分 试验结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 附录