结缕草抗寒性及转录因子CBF1的转化研究

论文摘要

结缕草在华北地区因冬季枯黄期长而观赏价值相对比较低。利用抗寒相关基因转化结缕草是提高其抗寒性的有效途径之一。本文研究了自然低温胁迫和人控低温胁迫下结缕草叶片衰老与抗寒相关生化调节;以烟草为模式植物,研究了拟南芥冷诱导基因转录因子CBF1表达对冷敏感植物抗寒性的影响;建立了中华结缕草的组织培养和植株再生体系,初步分析了农杆菌介导中华结缕草转化的影响因素。获得主要研究结果如下:1)结缕草的低温敏感性和抗寒相关生化调节15℃以下低温即诱导结缕草叶片衰老,12-8℃低温使衰老加速,表现为叶片含水量下降,叶绿素和可溶性蛋白逐渐降解,膜脂过氧化加快,长光周期促进低温衰老。12-8℃低温诱导叶片大量积累脯氨酸和积累可溶性糖,两种物质的含量增加有利于延缓叶片低温分解代谢和减轻膜脂过氧化。5℃以下低温使叶片分解代谢和抗寒相关调节均显著降低。匍匐茎在低温诱导下迅速、大量积累脯氨酸以及特异表达并积累可溶性蛋白,膜脂过氧化几乎不受影响。2)CBF1表达对转基因烟草植株的抗寒性及生长发育的影响CBF1表达使转基因烟草植株抗寒性增强,表现为转基因植株在低温胁迫下脯氨酸和可溶性糖含量更高,具有较高的光化学效率（Fv/Fm）,膜脂过氧化程度低;转基因植株明显矮壮,顶端优势削弱,叶绿素含量增加,叶厚,表面有光泽;植株生长发育滞后。植株抗寒性及形态变异程度与CBF1的表达水平成正相关。3)中华结缕草组织培养和植株再生体系的建立用30%（m/v）NaOH溶液处理种子60min,配合采用2%有效氯的NaClO溶液进行面表消毒,可以有效地解除种子休眠。在改良的MS基本成分（VB1 1mg/L、NH4NO3 1/2×MS） +酶水解酪蛋白0.5mg/L +葡萄糖20g/L+VB2 1mg/L + 2,4-D 2.0mg/L + 6-BA 0.1 mg/L培养基上,成熟胚愈伤组织诱导率达80%左右。愈伤组织继代培养后大致可以分为四种类型,即:Ⅰ型组织淡黄色,质地比较密实,再生率为45-50%;Ⅱ型组织乳白色至白色,质地较软,再生率低于10%;Ⅲ型组织白色,质地稀软,丧失再生植株能力;Ⅳ组织淡黄色至黄绿色,结构紧密,含分化了的幼芽（丛）,生长慢,再生率80%左右。Ⅰ型组织继代培养两次以后由于易于转化为其它类型组织而逐渐丧失再生植株能力。4)农杆菌介导中华结缕草转化的影响因素EHA105菌株对中华结缕草有较强侵染力,侵染条件为菌液OD600≈0.4、共培养4天、在侵染环境中添加100mg/L甘氨酸甜菜碱和利用60Kpa负压辅助侵染5min。建立成功的农杆菌介导中华结缕草转化体系尚需进一步研究。本研究结果将为结缕草种质抗寒性评价以及抗寒转基因育种研究提供有价值的理论和实践指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 我国草坪业发展概况
• 1.2 结缕草属植物评价与繁育研究进展
• 1.3 植物低温胁迫调节及抗寒基因工程研究进展
• 1.4 植物CBF 冷响应途径及抗寒转基因研究
• 1.5 草坪草转基因研究概况
• 1.6 本研究的主要内容及目的
• 2 结缕草的抗寒性及对低温胁迫的生化调节
• 2.1 自然低温胁迫结缕草衰老及其生化调节
• 2.2 光周期对结缕草低温衰老及生化调节的影响
• 2.3 结缕草生化调节与抗寒性的关系
• 3 转录因子CBF1 的转化与冷敏感植物抗寒育种
• 3.1 双元表达载体p3301UbiCbf1 的构建及转化农杆菌
• 3.2 CBF1 表达对烟草抗寒性及生长发育的影响
• 4 中华结缕草植株再生体系的建立
• 4.1 诱导中华结缕成熟胚产生愈伤组织的影响因素
• 4.2 中华结缕草愈伤组织继代培养的影响因素
• 4.3 愈伤组织再生植株的影响因素
• 5 农杆菌介导中华结缕草遗传转化的影响因素分析
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 6 总结与展望
• 6.1 主要研究成果
• 6.2 后续研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 博士期间发表的研究论文目录