肺炎支原体p1基因分型与变异的研究

论文摘要

目的：检测上海市从儿童呼吸道感染患者中分离的134例肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae, Mp）临床分离株的基因型，分析p1基因RepMP4和RepMP2/3多态区的变异情况，为了解我国上海Mp的流行情况及免疫逃避机制、确定p1基因的保守序列，以进一步开发Mp诊断试剂盒和制备Mp疫苗控制其感染提供实验依据。方法：对上海市复旦大学附属华山医院20052009年分离的134株Mp临床株用支原体肉汤培养基（CM403）进行复苏传代后，用支原体琼脂培养基（CM401）进行单个菌落培养，再用PCR进一步鉴定。然后通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）、巢式PCR（nested polymerase chain reaction,nPCR）和快速循环PCR（rapid-cycle polymerasechain reaction, Rapid-Cycle PCR）对134株Mp临床分离株进行MpⅠ、MpⅡ的基因分型，并比较这3种方法在基因分型中的作用；设计特异性引物，PCR分别扩增Mp p1基因的多态区RepMP4和RepMP2/3区，通过RFLP、变性梯度凝胶电泳技术（DenaturingGradient Gel ElectroPhoresis, DGGE）和基因测序分析p1基因变异情况，并比较PCR-RFLP、PCR-DGGE法在检测基因变异的作用。结果：基因分型结果显示：134例Mp临床标本中，nPCR法分型发现各Mp标准株、临床株均同时扩增出MpⅠ、Ⅱ型目的片段；Rapid-Cycle PCR法检出MpⅠ型117例（87.31%），MpⅡ型12例（8.96%），5例均未有MpⅠ、Ⅱ型别结果显示（3.73%）；PCR-RFLP法检出MpⅠ型122例（91.04%），MpⅡ型12例（8.96%）；134例Mp临床株中，PCR-RFLP检测出14例临床突变株；PCR-DGGE和基因测序这两种方法除检测出PCR-RFLP法所检测出来的14株外，还发现4株临床突变株。在这18例临床突变株中，我们发现菌株Mp05、Mp21、Mp26、Mp53、Mp56、Mp61、Mp99、Mp132共8株为MpⅡ型V2c突变株；菌株Mp22、Mp34共2株为MpⅡ型V2a突变株；Mp3、Mp10、Mp16、Mp54、Mp59、Mp96、Mp126、共7株MpⅠ型发生了点突变。在所有突变株中，Ⅰ型突变株7例（占Ⅰ型Mp的5.73%），Ⅱ型突变株11例（占Ⅱ型Mp的91.7%）。此外，我们还发现了一株新型V2型突变株Mp100，其p1基因的序列均不同于Ⅰ、Ⅱ型，与目前报道过亚型和突变型相比也均有很大的差异，但其p1基因RepMP4区最接近309（V2a），RepMP2/3区域中有142bp（27722913）序列与已报道过的p1基因变异情况均不相同，其完全同源重组了一段Mp基因座上p1基因以外的RepMP2/3-J序列（606517606658）。根据目前关于Mp临床突变株的研究，我们将此突变型命名为V2d型突变株。结论：1. PCR-RFLP法能准确对Mp进行分型，134株Mp临床株主要为Ⅰ型。2.134例Mp菌株中有18例发生p1基因突变，Ⅱ型突变率明显高于Ⅰ型。PCR-DGGE法检测变异的敏感性显著高于PCR-RFLP法。3.发现一株新的p1基因亚型突变株（MP Ⅱ型V2d）。

论文目录

• 主要缩略语英文索引
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 致谢