体外冲击波对兔骨性关节炎软骨细胞凋亡及caspase-3活性影响的实验研究

论文摘要

目的:体外冲击波疗法（Extracorporeal Shock Wave Therapy, ESWT）作为骨科领域兴起的新的非侵入性治疗方法,在治疗某些矫形外科和软组织疾病方面较传统外科方法存在许多优势。近年来,发现体外冲击波（Extracorporeal Shock Wave,ESW）在治疗动物骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）中有显著疗效,其未见相关基础研究报道。而既往膝关节OA研究很少注重软骨细胞生存或死亡在OA发生发展中所起的作用。本课题利用体外培养的正常原代软骨细胞,施加不同能量强度和次数的ESW分别处理,检测ESW对软骨细胞增殖情况的影响,筛选出最佳能量强度和频次的ESW进行动物实验。建立兔膝关节OA模型并施加已筛选出ESW给予干预,检测软骨细胞凋亡动态,评估OA软骨修复情况,探讨ESW抑制炎症,防止软骨细胞凋亡及促进软骨修复作用的分子机理。论证ESW作为延缓OA发生发展的非侵入治疗方法的可行性,为下一步临床应用提供理论依据。方法:第一部分:ESW对正常兔膝软骨细胞代谢影响。不同能量和频次的ESW处理由酶法消化获得正常兔膝软骨细胞。利用CCK-8法筛选出ESW促进软骨细胞增殖最佳参数,倒置显微镜形态观察,HE染色分析干预效果。第二部分:前交叉韧带（Anterior Cruciate Ligament,ACL）离断法建立兔膝OA模型,研究最佳ESW作用兔膝关节4,8周后,通过形态学观察,组织染色,DAPI、TUNEL法和流式细胞Annexin V-FITC法,关节液NO含量和caspase-3活性测定,检测兔膝关节软骨细胞凋亡、NO及caspase-3变化情况,了解ESW对兔膝OA软骨细胞凋亡的影响。对上述各部分实验数据采用单因素方差分析和非参数秩和检验,以p < 0.05为有统计学差异,运用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果:（1）酶法消化获得正常兔膝原代软骨细胞。倒置显微镜观察软骨细胞形态呈轮廓清晰圆形,核明亮清楚,悬浮在培养液中,细胞大小略有差异。4h后大部分细胞开始贴壁,细胞也逐渐变得扁平透亮。24h后软骨细胞开始出现突起,细胞逐渐变成多边形。2天后,软骨细胞连片生长,边缘细胞突起较长,细胞偏梭形,中央的细胞突起较短,呈多角形,似铺路石样改变。（2）体外培养正常兔膝软骨细胞经ESW干预后增殖能力较对照组明显提高,HE染色软骨细胞呈多角型,胞浆丰富、红染,伸出多个长的足突,细胞核较大,可见2-3个核仁;对照组软骨细胞呈三角型、梭型,胞浆较少、红染,细胞核呈深蓝色,较小,核仁不明显。（3） ESW对正常兔膝软骨细胞的影响显著。按参数强度1.5×105Pa和次数600次的ESW干预后,软骨细胞增殖活性达最高,进而随能量、次数升高软骨细胞增殖活性明显下降。（4）兔膝ACLT造模后出现典型的OA病理变化。而ESW干预后4w实验组,软骨分层结构尚可,细胞增殖分化好,甲苯胺蓝染色正常,潮线完整;8w实验组,裂隙达到移形层,细胞弥散性增多,甲苯胺蓝染色轻度降低,潮线不完整。4w,8w实验组分别同相应对照组相比Moran大体评分和Markin评分有显著性差异（P<0.01）。（5）ESW干预后的实验组软骨细胞凋亡率明显低于同期对照组（P<0.01）。DAPI染色凋亡软骨细胞表现为致密浓染或呈碎块状不均匀着色细胞核,而正常软骨细胞核显示均匀蓝色荧光;TUNEL法具有特异性标记凋亡软骨细胞呈绿色荧光,主要集中在浅表和中间层;annexinⅤ-FITC/PI双标流式细胞仪检测示,ESW干预后4w,8w实验组软骨细胞凋亡率为4.637±0.241% ,10.240±0.760%而相应对照组10.178±0.661%,17.465±0.621%的软骨细胞凋亡,有统计学差异（P<0.01）。（6）兔膝关节液NO,实验组与对照组随着时间延长NO含量均有降低趋势。4w,8w实验组同其对照组相比,兔膝关节液的NO含量较低有统计学差异（P<0.01）。（7） caspase-3阳性细胞核膜及细胞浆着棕黄色,实验组与相应对照组相比有显著性差异(（P<0.01）。实验组软骨中caspase-3表达不均衡,在浅表层表达,在中间层和辐射层少量表达,4w,8w阳性细胞比率分别为15.4±1.8%,38.4±3.2%;而对照组以浅层和中间层表达明显,相应阳性细胞比率为40.4±2.7%,70.4±3.9%。结论:（1）ESW作为机械应力在一定能量强度和次数的情况下显著促进软骨细胞增殖。证实软骨细胞是对ESW应力敏感细胞,具有能量依赖性和积累效应。（2） ESW能有效的抑制软骨细胞的凋亡,通过抑制软骨细胞中caspase-3的表达,减少关节液中NO含量来实现延缓软骨退变,发挥软骨保护功能。ESW是一种有前途的无创性治疗OA的方法,具有重要的临床意义和实践意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 体外冲击波对兔骨性关节炎软骨细胞凋亡及caspase-3 活性影响的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 骨性关节炎软骨细胞凋亡的研究进展
• 致谢
• 个人简历