枯草芽孢杆菌BS501a发酵工艺优化和温室防效研究

论文摘要

稻瘟病是由水稻稻瘟病菌引起的一种真菌病害，严重影响水稻产量。由于具有稻瘟病抗性的水稻品种抗性易于丢失，化学农药防治稻瘟病造成环境污染，因此稻瘟病的生物防治研究具有重要意义。枯草芽孢杆菌BS501a是从稻田土壤中分离出来的一株对稻瘟病菌有良好拮抗活性的细菌，具有很好的应用前景。本实验对枯草芽孢杆菌BS501a发酵工艺进行优化，提高其拮抗活性，降低生产成本，为规模化生产奠定基础。本研究从发酵培养基和发酵条件两方面对枯草芽孢杆菌BS501a的发酵工艺进行优化。首先利用单次单因素试验筛选最适碳源为大豆粕，最适氮源为花生饼粉，然后采用Plackett-Burman（PB）试验筛选出影响拮抗活性的显著因素为大豆粕、花生饼粉、KH2PO4。利用中心组合试验对PB试验筛选出的三个显著影响因素进一步优化，获得最佳发酵培养基和发酵条件：大豆粕3.2%，花生饼粉1.21%，酵母膏0.5%，KH2PO40.07%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O0.05%，MnSO4·H2O0.01%，FeSO4·7H2O0.01%，CaCl20.15%，初始pH为7.2，接种量5%，培养温度37℃，装瓶量为100mL/500mL。该条件下BS501a的拮抗活性可达91.6%，比优化前提高了26.7%，与基础培养基相比提高了6%；优化后培养基生产成本每吨降低900元。本实验研究了枯草芽孢杆菌BS501a发酵液拮抗稳定性，结果显示在低于45℃条件下保存10d，菌丝生长抑制率仅下降2.3%，而当外界环境温度高于60℃时，10d后菌丝生长抑制率下降27.3%；发酵液在pH79条件下活性较强，发酵液中拮抗活性物质在碱性条件下可溶于水，在酸性条件下呈不溶性沉淀；在光照强度4500±500lx下光照10d，菌丝生长抑制率仅下降0.7%；发酵液中的拮抗活性物质不能被蛋白酶K降解。综上所述，枯草芽孢杆菌BS501a发酵液中拮抗活性物质理化性质稳定。将枯草芽孢杆菌BS501a转接10代，其发酵液菌丝生长抑制率仅下降0.3%，说明枯草芽孢杆菌BS501a遗传稳定性良好。温室条件下研究枯草芽孢杆菌BS501a对稻瘟病菌的防治效果。结果表明，枯草芽孢杆菌BS501a对稻瘟病菌有良好的防治效果，防治效率为63.8%，是一株具有应用价值的生防细菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 枯草芽孢杆菌防治植物病害概况
• 1.1.1 国外枯草芽孢杆菌应用概况
• 1.1.2 国内枯草芽孢杆菌应用概况
• 1.2 枯草芽孢杆菌在植物病害防治中存在的问题与对策
• 1.3 影响枯草芽孢杆菌发酵的因素
• 1.3.1 培养基组分对发酵的影响
• 1.3.2 发酵条件对发酵的影响
• 1.4 微生物发酵过程的优化方法
• 1.4.1 单次单因素法
• 1.4.2 正交试验设计
• 1.4.3 典型分析法
• 1.4.4 单纯形法
• 1.4.5 响应面法
• 1.5 响应面法的应用现状
• 1.5.1 Plackett-Burman法
• 1.5.2 部分因素设计法
• 1.5.3 中心组合设计法
• Behnken设计法'>1.5.4 Box_Behnken设计法
• 1.6 本论文研究的目的、意义和主要内容
• 1.6.1 研究的目的和意义
• 1.6.2 研究的主要内容
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌BS501a发酵液的制备
• 2.2.2 稻瘟病菌的培养
• 2.2.3 稻瘟病菌菌饼的制备
• 2.2.4 枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清拮抗活性的测定
• 2.2.5 枯草芽孢杆菌BS501a生长曲线的测定
• 2.2.6 单因素法筛选合适碳氮源
• 2.2.6.1 碳源筛选
• 2.2.6.2 氮源筛选
• 2.2.7 响应面法优化发酵培养基
• 2.2.7.1 筛选显著影响因素
• 2.2.7.2 最陡爬坡试验
• 2.2.7.3 中心组合试验
• 2.2.7.4 响应面分析
• 2.2.7.5 模型验证
• 2.2.8 枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清拮抗稳定性试验
• 2.2.8.1 热稳定性试验
• 2.2.8.2 酸碱稳定性试验
• 2.2.8.3 光照稳定性试验
• 2.2.8.4 遗传稳定性试验
• 2.2.8.5 蛋白酶稳定性试验
• 2.2.9 稻瘟病菌孢子悬液制备
• 2.2.10 水稻温室栽培
• 2.2.11 稻瘟病菌致病性检测
• 2.2.12 温室防效测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定
• 3.2 单因素法筛选碳氮源
• 3.2.1 单因素法筛选碳源
• 3.2.2 单因素法筛选氮源
• 3.3 响应面法优化发酵工艺
• 3.3.1 显著影响因素的筛选
• 3.3.2 最陡爬坡路径
• 3.3.3 中心组合实验
• 3.3.4 响应面分析及最佳培养基配方确定
• 3.3.5 模型验证
• 3.4 枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清拮抗稳定性试验结果
• 3.4.1 热稳定性
• 3.4.2 酸碱稳定性
• 3.4.3 光照稳定性
• 3.4.4 遗传稳定性
• 3.4.5 蛋白酶稳定性
• 3.5 枯草芽孢杆菌BS501a发酵上清对稻瘟病的温室防效
• 3.5.1 稻瘟病菌致病性检测
• 3.5.2 温室防效测定
• 第四章 讨论
• 4.1 枯草芽孢杆菌拮抗活性测定方法
• 4.2 枯草芽孢杆菌BS501a发酵工艺的优化
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历