论文摘要
肝纤维化是各种病因的慢性肝损伤的共同转归,是全世界共同的公众健康威胁。早期发现肝纤维化并进行积极的干预,将可以很大程度控制甚至逆转肝纤维化。但是,目前还没有一种有效的早期肝纤维化无创评估方法。众多的研究已经证实肝星状细胞是肝纤维化过程中肝脏纤维发生的主要效应细胞。肝纤维化时,随着HSCs激活增殖、肝内血管新生,肝组织的整合素αvβ3表达水平上调。αvβ3是整合素蛋白中的ECM （extracellular matrix,细胞外基质）受体。它介导细胞和多种ECM黏附,并和细胞因子协同作用,是组织损伤修复和基质重塑的重要因素。精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸（arginine-glycine-asparagic acid, RGD）是对整合素高度靶向性配基的最常见识别位点。而精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-（右旋）酪氨酸-赖氨酸（RGDyK）、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-（右旋）苯丙氨酸-赖氨酸（RGDfK）等环肽表现出较线状肽更好的和整合素αvβ3受体特异结合的能力。分子影像学是用影像技术在活体内进行细胞和分子水平的生物过程的描述和测量的科学。目前分子影像学发展迅速,各种方法各有优点。将MR和光学成像结合,MR的高分辨率可弥补光学成像的不足。而光学成像可弥补MR对信号灵敏度的限制。因此我们设想构建一种靶向整合素αvβ3受体的多模态（磁性/光学）纳米探针,来对肝纤维化演变中各节点、各环节的重要事件进行高分辨率、高灵敏度的动态监测。鉴于课题的上述设计,本论文共分为五个部分。第一部分：靶向多模态纳米探针的设计、合成和表征[目的]选取合适的靶点,构建靶向多模态纳米探针,用于小鼠早期肝纤维化的诊断。[方法]固相合成靶向cRGDyK环肽并纯化。探索正确的路线将多肽、各种磁性、光学的成像基团修饰到载体dendrimer上,纯化,得到Den-RGD。从各个方面表征纳米探针,包括用1H NMR测定修饰基团和载体的比例、荧光基团比例的测定、MALDI-TOF MS和GPC法测定分子量、纳米探针粒径分布和Zeta电位的测定、ICP-AES对金属化程度的测定和纳米探针弛豫率的测定。同时合成不带有靶向基团的照探针Den-PEG,并用同样的方法进行表征。[结果]成功合成2种纳米探针,均为粒径8-12nm、分子量80-95kDa、带有正电荷的纳米颗粒。[结论]：靶向纳米探针的成功合成,为之后的体内、体外实验奠定了基础。第二部分：体外细胞实验验证纳米探针的细胞毒性和体外靶向作用[目的]验证纳米探针的细胞毒性和体外靶向作用。[方法]用改良后的酶解消化、密度梯度离心法分离小鼠原代肝星状细胞（HSC）,培养后用油红0染色、desmin和α-SMA免疫荧光染色进行纯度鉴定。用MTT实验检测Den-RGD和Den-PEG对小鼠原代HSCs的毒性。用Western Blot技术鉴定活化小鼠原代HSCs对β3受体的表达。用流式细胞技术检测Den-RGD和Den-PEG和HSCs结合的能力。在共聚焦显微镜下观察不同条件下Den-RGD和Den-PEG和HSCs结合、内化的情况。[结果]修饰后的G5一dendrimer对HSCs细胞毒性都比未修饰时显著降低,IC50从小于0.5μM变为大于5μM。活化的小鼠原代HSCs表达相当量的β3受体,但少于U87MG。Den-RGD和小鼠原代活化HSCs的结合迅速,并随时间增加迅速,24小时后仍是Den-PEG的2.86倍,并且这种结合可以被RGD竞争性抑制。[结论]所构建纳米探针的细胞毒性低。纳米探针可通过受体、配体作用在体外与靶细胞大量、迅速结合。第三部分：TAA诱导的小鼠肝纤维化模型的建立及靶向纳米探针在模型体内的生物分布[目的]建立动物模型。精确确定靶向纳米探针各时间点时在模型小鼠体内的分布,评估靶向纳米探针进行活体光学、磁共振成像的可行性。[方法]建立C57BL/6J小鼠三个不同造模时间的肝纤维化模型,H&E染色、天狼星红染色鉴定造模是否成功。用125I修饰纳米探针,正常和模型小鼠尾静脉分别注射一种纳米探针5-10μCi/只,注射后2h和24h分别处死小鼠,取出心、肝、脾、肺、肾、适量肌肉、脑等器官,进行单位放射性活度的计算。靶组织冰冻切片,进行放射自显影,定量分析。[结果]纳米探针普遍在肝、肾、脾中分布较多。125I-Den-RGD在肝纤维化模型小鼠体内肝脏内的分布显著增加。模型小鼠肝中,探针Den-RGD都比探针Den-PEG的沉积显著增加,单位放射性活度（%ID/g）2h时是7.96±0.47比5.48±0.33,24h时是4.22±0.15比1.71±0.13。肝组织切片放射自显影勾勒出模型小鼠肝内的条索状信号增强区,定量结果和生物分布吻合。[结论]靶向纳米探针由于受体、配体的结合在肝纤维化模型靶组织中聚集增多、驻留时间延长,为活体成像提供了理论基础。第四部分：用光学方法追踪靶向多模态纳米探针的分布[目的]利用探针上的光学基团追踪靶向多模态纳米探针在活体、离体组织中的分布,以及在切片上结合免疫荧光技术追踪探针结合部位和受体的关系。[方法]正常和模型C57BL/6J小鼠尾静脉注射4.0nmol的Den-RGD/Den-PEG 24h后各脏器用活体成像仪定性显示探针分布。冰冻切片共聚焦显微镜观察探针在肝内的沉积。[结果]纳米探针在大体荧光成像中显示的结果和生物分布、病理切片结果吻合。免疫荧光染色发现,随着造模时间的增加,探针Den-RGD在肝脏内的沉积增多,分布的变化和天狼星红染色中胶原分布的变化一致。每一造模时间点,Den-PEG在肝脏内的沉积与Den-RGD相比显著减少,而且Den-RGD在肝脏内的沉积可以被RGD明显阻断。Den-RGD与β3和α-SMA在汇管区、纤维隔及其附近共定位良好。肝内表达整合素αvβ3,并和Den-RGD结合,而起到成像作用的主要是肝活化的星状细胞,肝内新生血管内皮细胞作用较小,而巨噬细胞、枯否细胞等肝其他间质细胞基本上未起到作用。[结论]近红外荧光成像及RGD阻滞试验结果说明,探针的沉积部位基本上是由RGD与肝星状细胞上的整合素αvβ3受体的结合介导,少数是由RGD与肝内新生血管内皮细胞上的整合素αvβ3受体的结合介导,同时免疫荧光染色结果提示Den-RGD与α-SMA、β3共定位良好,为以后的磁共振成像研究奠定了基础。第五部分：磁共振无创评估模型小鼠肝纤维化的初步研究[目的]探索磁共振无创性评估模型小鼠肝纤维化的可行性。[方法]正常及模型小鼠从尾静脉分别注射0.05 mmol/kg[Gd3+]的各种纳米探针后,在Bruker Biospec 47/30小动物磁共振仪上,收集注射前、后各个时间点靶器官动态T1加权图像,测得T1信号强度。感兴趣区（ROI）在时间点的增强强度（IE）通过以下公式表示IE=（RI（t）-RI（0））／RI（0）×100％,其中,RI（t）对应于在各个时间点测定的标准化的信号强度,用这个时间点同一层面的肌肉的信号强度标准化,即RI（t）=T1（肝）t/T1（肌肉）,而RI（0）是纳米探针注射前标准化的信号强度,用注射前肌肉的信号强度标准化。统计分析所得数据。[结果]肝纤维化模型实验中,Den-RGD、Den-PEG尾静脉注射入正常C57BL/6J小鼠中24h后,小鼠肝脏的T1加权图像信号无差别。造模4周小鼠中,24h后,注射Den-RGD的小鼠肝脏信号和注射Den-PEG的小鼠肝脏信号有差异（*P<0.05）,且可被RGD竞争性抑制（*P<0.05）。造模8、12周小鼠中,24h后,注射Den-RGD的小鼠肝脏信号和注射Den-PEG的小鼠肝脏信号有显著差异（**P<0.01）,且可被竞争性抑制（**P<0.01）。各组间比较发现,24h后,造模4周的小鼠肝脏T1信号高于正常小鼠（*P<0.05）；造模8周的小鼠肝脏Tl信号高于造模4周的小鼠（*P<0.05）；造模12周的小鼠肝脏T1信号显著高于造模8周的小鼠（**P<0.01）。[结论]从正常小鼠到肝纤维化早、中、晚期小鼠,靶向纳米探针所造成的MRIT1加权图像信号增强并逐级递增,与肝纤维化程度明显相关。因此,此纳米探针成像系统有望用于早期肝纤维化的磁共振成像无创诊断。