禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究

论文摘要

禽的大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）引起的一种常见的细菌性疾病,对养禽业危害极大,同时具有公共卫生意义。新生儿脑膜炎大肠杆菌（Neonatal meningitis E. coli, NMEC）是导致新生儿脑膜炎主要病原菌之一,目前在NMEC的研究中,已确定ibeA、ibeB、yijP、aslA、ypdP和ompA等多个基因与其穿越血脑屏障有关。APEC和NMEC在基因组结构上很相似,且具有很多相同的毒力因子。侵袭并穿越血脑屏障是细菌导致脑膜炎的关键步骤,侵袭相关基因ibeB、yijP在APEC中广泛分布,显示其具有重要的公共卫生意义。根据已登陆GenBank的侵袭相关基因ibeB、yijP的序列,设计并合成两对引物,检测ibeB、yijP基因在100株不同来源、不同地区大肠杆菌中的分布,结果表明,所有菌株都含有ibeB、yijP基因。以APEC鸭源株DE205B株基因组为模板PCR扩增ibeB和yijP开放阅读框,连接pMD18-T载体后测序。将测序结果与GenBank中APEC O1、BL21（DE3）、CFT073、RS218、UT189、O157:H7菌株进行比对和进化树分析。结果显示,DE205B的ibeB、yijP基因与上述菌株有较高同源性,同源率在96.9%-100%之间。对不同菌株的ibeB和yijP基因进行进化树分析表明,DE205B与APEC O1、RS218、UT189同处于一个小进化分枝中,亲缘关系较近；与O157:H7、BL21（DE3）亲缘关系较远,与CFT073的亲缘关系介于前两个类群之间。将DE205B的ibeB和yijP基因全长序列定向克隆于经同样酶双酶切的pET-32a（+）中,转化表达宿主菌BL21 （DE3）.经IPTG诱导可表达分子量约69.3kDa、83.4kDa的IbeB、YijP重组蛋白。超声破碎,裂解物作SDS-PAGE凝胶电泳,显示两个蛋白条带,均存在于包涵体。免疫转印结果显示,IbeB、YijP重组蛋白都能被DE205B全菌抗血清识别,表明二者具备免疫原性。蛋白经镍柱纯化、透析脱盐复性,分别免疫新西兰大白兔,获得效价较高的免疫血清。侵袭抑制试验证明,免疫血清能抑制DE205B对DF-1细胞的侵袭。为进一步研究ibeB基因的功能,利用Red重组系统构建DE205B ibeB基因缺失株及其互补株。对野生株、缺失株、互补株的生物学特性进行分析,结果显示,ibeB缺失株对小鼠及雏鸭的致病力低于野生株,且互补株的致病力高于缺失株,提示ibeB在APEC的致病过程中发挥一定作用。ibeB缺失株对DF-1细胞和脑组织的侵袭能力显著低于野生株（P<0.05）,且互补株的侵袭能力显著高于缺失株（P<0.05）,提示ibeB基因在APEC侵袭细胞并穿透血脑屏障过程中发挥一定作用。ibeB缺失株中ibeA基因的相对表达率低于野生株,且互补株中ibeB基因的相对表达率高于缺失株,提示ibeB基因可能通过调控ibeA基因的表达水平影响APEC的致病能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 禽致病性大肠杆菌的研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床类型和病理变化
• 4 致病机理
• 5 大肠杆菌毒力因子
• 5.1 黏附素
• 5.2 摄铁系统
• 5.3 温度敏感性血凝素
• 5.4 抗血清存活因子
• 5.5 毒素（Toxin）
• 6 结束语
• 参考文献
• 第二章 大肠杆菌侵袭血脑屏障机理研究
• 1 血脑屏障的结构
• 2 大肠杆菌侵袭血脑屏障的过程
• 2.1 菌血症
• 2.2 大肠杆菌粘附于HBMEC
• 2.3 大肠杆菌侵袭血脑屏障
• 2.4 大肠杆菌引起的细胞骨架重排
• 2.5 大肠杆菌在穿越过程中保持活性
• 3 侵袭相关毒力因子
• 3.1 OmpA
• 3.2 K1荚膜
• 3.3 CNF1
• 3.4 Ibe蛋白
• 3.5 Ⅰ型菌毛
• 3.6 其他因子
• 4 结束语
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 侵袭相关基因ibeB、yijP在不同来源大肠杆菌中的分布及序列分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.3 菌株的培养
• 1.4 DNA的提取和PCR扩增
• 1.5 PCR产物的T/A连接
• 1.6 连接产物的转化
• 1.7 重组质粒的提取与酶切鉴定
• 1.8 测序及序列分析
• 2 结果
• 2.1 PCR检测
• 2.2 克隆载体pMD-T-ibeB、pMD-T-yijP的构建
• 2.3 序列分析
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第四章 APEC鸭源株DE205B侵袭相关基因ibeB、yijP的克隆表达
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 要试剂与仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 菌株的培养
• 1.5 表达菌株的构建与鉴定
• 1.6 重组蛋白的表达
• 1.7 兔抗DE205B全菌血清的制备
• 1.8 表达蛋白的纯化与复性
• 1.9 纯化蛋白抗血清的制备及多抗效价的测定
• 1.10 DE205B的侵袭抑制实验
• 2 结果
• 2.1 重组质粒的鉴定和蛋白的分析与鉴定
• 2.2 表达产物的鉴定与纯化
• 2.3 免疫血清效价的间接ELISA检测
• 2.4 侵袭抑制实验
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第五章 APEC鸭源株DE205B ibeB基因缺失株的构建及其特性分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 ibeB基因上下游序列的测定
• 1.3 PCR引物设计和线性打靶DNA的制备
• 1.4 DE205B电击感受态细胞的制备及电击转化
• 1.5 DE205B/pKD46电击感受态细胞的制备及电击转化
• 1.6 缺失株的筛选与鉴定
• 1.7 互补株的构建
• 1.8 生长曲线的测定
• 1.9 荧光定量PCR进行表达量分析
• 1.10 半数致死量（LD50）的测定
• 1.11 动物感染实验
• 1.12 细胞侵袭试验
• 2 结果
• 2.1 线性打靶DNA的制备
• 2.2 缺失株的PCR鉴定
• 2.3 补株的构建
• 2.4 Real-time PCR
• 2.5 半数致死量（LD50）的测定
• 2.6 动物感染试验
• 2.7 生长曲线的测定
• 2.8 细胞侵袭试验
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 全文总结
• 致谢