力信号调控的大鼠成骨细胞力生长因子表达及其对成骨细胞生理行为的影响

论文摘要

本文采用了生物力学、细胞生物学、生物化学及分子生物学等方法,研究机械拉伸对成骨细胞力生长因子表达的影响和力生长因子对成骨细胞增殖和分化以及相关基因的影响。主要内容和结果如下:改进了周期性基底膜拉伸应变装置。改进后该装置接种细胞量大,避免了以往实验中多次收集细胞的麻烦。该装置组装简便,应变大小可由注入储液囊的流体体积决定,频率由控制系统的开关频率调节,操作方便。运用组织块法培养了满足实验需求的大鼠颅骨成骨细胞,并利用差时贴壁法对其进行了纯化。通过形态观察、Von Kossa染色和碱性磷酸酶（ALP）染色等方法进行了鉴定。结果表明所培养细胞具有成骨细胞的典型生物学行为,可以用于后续实验。第二代至第六代的细胞用于后续实验。对细胞施加应变量为15%周期性拉伸刺激,作用6h、12h、24h、36h后,分别收集细胞,提取蛋白质,利用western blot法检测是否有力生长因子（MGF）表达。结果显示,在6h、24h时有少量MGF表达,12h时较多,对照组和36h未观察到。以成骨细胞株MC3T3为对象,研究了力生长因子对细胞增殖和分化的影响。将力生长因子配成一定浓度的溶液,分别加入到接种细胞的96孔板中,用MTT法检测其对细胞增殖的影响。利用碱性磷酸酶检测试剂盒检测ALP活性,分析其对细胞分化的影响。结果显示,10ng/ml MGF明显促进成骨细胞的增殖,抑制ALP分泌。利用RT-PCR方法分析了加入MGF后细胞中BMP-2、Cbfα-1、Col I、OCN mRNA表达的变化。结果显示,10 ng/ml MGF促进BMP-2、Cbfα-1、Col I mRNA的表达,抑制OCN mRNA的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 MGF 的背景资料及国内外研究现状
• 1.1.1 MGF 的产生
• 1.1.2 MGF 的作用
• 1.1.3 MGF 的应用
• 1.1.4 国内外研究现状
• 1.2 问题的提出及研究意义
• 1.3 本文研究目的和研究内容
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究内容
• 2 拉伸应变加载装置的结构及原理
• 2.1 引言
• 2.2 周期性基底膜拉伸应变装置
• 2.2.1 实验材料和设备
• 2.2.2 周期性基底膜拉伸应变装置的机构和工作原理
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 成骨细胞的体外培养、纯化和鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 成骨细胞的培养
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 实验试剂及主要器材设备
• 3.2.3 细胞培养过程
• 3.3 成骨细胞的纯化
• 3.3.1 纯化方法
• 3.4 成骨细胞的形态学观察结果
• 3.4.1 原代培养细胞的显微镜观察结果
• 3.4.2 传代培养细胞的显微镜观察结果
• 3.5 成骨细胞的鉴定
• 3.5.1 Von Kossa 法染色鉴定
• 3.5.2 碱性磷酸酶染色鉴定
• 3.5.3 鉴定结果
• 3.6 讨论
• 3.7 本章小结
• 4 机械拉伸对成骨细胞MGF 蛋白质表达的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验试剂及配制
• 4.2.2 实验器材及设备
• 4.3 实验过程
• 4.3.1 接种细胞及拉伸刺激
• 4.3.2 蛋白质的提取
• 4.3.3 SDS-PAGE 电泳
• 4.3.4 转膜
• 4.3.5 蛋白质丽春红S 染色
• 4.3.6 封闭滤膜的免疫球蛋白结合位点
• 4.3.7 结合第一抗体
• 4.3.8 结合第二抗体
• 4.3.9 显色
• 4.4 实验结果
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 5 力生长因子对成骨细胞增殖和分化的影响
• 5.1 引言
• 5.2 力生长因子对成骨细胞增殖的影响
• 5.2.1 实验试剂
• 5.2.2 实验器材及设备
• 5.2.3 实验原理
• 5.2.4 实验方法
• 5.2.5 实验结果及分析
• 5.3 力生长因子对成骨细胞分化的影响
• 5.3.1 实验试剂
• 5.3.2 实验器材及设备
• 5.3.3 实验方法
• 5.3.4 实验结果及分析
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 6 力生长因子对成骨细胞相关基因的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料
• 6.2.1 实验试剂
• 6.2.2 实验器材及设备
• 6.3 实验过程
• 6.3.1 实验前准备
• 6.3.2 接种细胞
• 6.3.3 总RNA 提取
• 6.3.4 引物的设计与合成
• 6.3.5 反转录合成单链cDNA
• 6.3.6 PCR 反应
• 6.3.7 琼脂糖凝胶电泳
• 6.3.8 图像处理及灰度分析
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 细胞总RNA 质量及浓度测定
• 6.4.2 MGF 对成骨细胞Col I、BMP-2、Cbfα1、OCN 表达的影响
• 6.5 讨论
• 6.6 本章小结
• 7 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录