苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究

论文摘要

每年，农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害，是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringensis）对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性，并且，对人畜安全，不污染环境。目前，已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。特别是，随着植物基因工程的发展，利用转基因植物来防治害虫已经进入到实际运用阶段，其中，在抗虫转基因植物方面，Bt杀虫基因得到了最为普遍的应用。本研究在克隆新的cry基因的基础上，用Cry2Ab、Cry2Aa、Cry1Ca、Vip3Da或Vip3Af杀虫蛋白对水稻二化螟、大螟的杀虫活性进行了生物活性分析；改良了培养Bt菌株的传统牛肉膏蛋白胨培养基。1．本文从实验室自行分离的C006菌株中，经PCR扩增鉴定、酶切分析和构建质粒DNA文库的方法，获得了含有10kb阳性片段转化子，对其进行亚克隆，经测序分析发现该片段含有2种cry基因，其中一个是新的cry1类基因，与己知的cryl类基因的同源性低于80％，并在GeneBank中登记，序列注册号为EF550989。另一个基因核苷酸序列与cry1Ab13一致。2．将crylGb2全长基因分别插入Bt和E coli表达载体，在大肠杆菌BL21和苏云金芽胞杆菌HD73-中分别表达出133kDa的Cry蛋白，并且在Bt无晶体突变株中能形成典型的双锥体型晶体。这种新蛋白对小菜蛾进行生物活性测定，具有很强的毒力，LC50为7.48μg／mL。3．针对水稻重要鳞翅目害虫二化螟和大螟，从本组已有的基因中选用15种，分别进行单一蛋白杀虫活性筛选，结果表明对水稻二化螟幼虫具有活性的Cry2Aa、Cry2Ab、Vip3Da蛋白，它们的致死中浓度LC50分别为：27.59、13.88和10.29μg／g；毒蛋白组合Cry1Ab与Cry2Aa、Cry1Ab与Cry2Ab、Cry1Ab与Vip3Da、Cry1Ca与Cry2Aa、Cry1Ca与Cry2Ab、Cry1Ca与Vip3Da对二化螟LC50分别为：0.39、0.43、0.15、0.79、0.64和3.39μg／g，不同毒蛋白的协同增效作用显著。4．对夜蛾科害虫大螟的杀虫结果表明：Cry1Ca对水稻大螟具有较显著的活性，Cry1Ca对水稻大螟的LC50为4.28μg／g，Vip3Aa为16.64μg／g，Vip3Af为57.54μg／g，Vip3Da为13.93μg／g。5．对几种不同的Bt培养基进行优化，获得了最佳的配方：含有50mMTris-HCl、pH为7.2的牛肉膏蛋白胨培养基，能获得最大产量的蛋白晶体，该培养基稳定的缓冲能力，减少了晶体在培养过程中的溶解，有效地抑制了Bt菌株内源蛋白酶对晶体蛋白的降解。6．对造成中国林木严重危害的黄斑星天牛的饲养与生物测定方法进行了筛选和探索，建立了饲养和生测方法：同时也筛选到两株对天牛有毒杀活性的菌株，这将为以后对天牛具有杀虫活性的Bt基因的筛选奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.引言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌
• 1.2 苏云金芽胞杆菌的毒素
• 1.3 杀虫晶体蛋白的类型
• 1.4 杀虫晶体蛋白的作用机制
• 1.4.1 晶体在昆虫中肠中的溶解
• 1.4.2 中肠膜受体与毒蛋白的结合
• 1.4.3 杀虫晶体蛋白引起细胞裂解的机制
• 1.4.4 杀虫晶体蛋白引起膜穿孔的分子机制
• 1.5 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的应用
• 1.5.1 植物抗虫基因工程
• 1.5.2 重组苏云金芽胞杆菌
• 1.6 苏云金芽胞杆菌应用的局限性
• 1.7 克服苏云金芽胞杆菌的应用局限性
• 1.7.1 苏云金杆菌的增效途径
• 1.7.2 Bt蛋白的协同增效
• 1.8 营养期杀虫蛋白
• 1.9 重要的林业和农业害虫
• 1.9.1 黄斑星天牛
• 1.9.2 小菜蛾
• 1.9.3 水稻大螟
• 1.9.4 水稻二化螟
• 1.10 本论文研究的目的与意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 方法
• 2.2.1 cry基因PCR-RFLP鉴定
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 模板制备
• 2.2.4 PCR反应
• 2.2.5 酶切分析
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制各
• 2.2.8 Bt电击感受态的制备
• 2.2.9 热击转化
• 2.2.10 电击转化
• 2.2.11 E.coli质粒DNA提取
• 2.2.12 Bt质粒DNA提取
• 2.2.13 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.14 DNA回收
• 2.2.15 基因在大肠杆菌中诱导表达
• 2.2.16 基因在苏云金芽胞杆菌中的表达
• 2.2.17 SDS-PAGE电泳
• 2.2.18 序列测定及分析
• 2.2.19 杀虫测定
• 2.2.20数据分析处理
• 3.试验结果
• 3.1 新基因的筛选克隆
• 3.2 cry1Gb2全长基因的表达
• 3.2.1 cry1Gb2全长基因的表达
• 3.2.2 杀虫生物活性测定
• 3.3 Bt菌株在几种培养基中生长状况的比较
• 3.4 对已克隆基因进行表达
• 3.5 Bt杀虫蛋白对水稻螟虫的生物活性测定
• 3.5.1 Bt蛋白对水稻二化螟生物活性测定
• 3.5.2 Bt蛋白对水稻大螟生物活性测定
• 3.6 黄斑星天牛饲养及利用Bt蛋白进行活性筛选方法初试
• 4.讨论
• 5.结果
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术.论文