大鲵皮肤cDNA文库构建，ESTs分析及Arpc5l、Dynll2基因的组织表达

论文摘要

中国大鲵（Andrias davidianus blanchard）俗称娃娃鱼,属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科,是我国特有的大型珍稀两栖动物,经济价值和药用价值极高,目前已成为大鲵主产地的水产养殖新品种。近年来已在两栖动物皮肤中发现大量有很高应用价值的活性物质,但尚无大鲵皮肤活性成分的报道。cDNA文库构建是发现、获得新基因的重要手段之一,同时建立濒危野生动物cDNA文库也是物种保护和种质资源保存的最为有效的方法。为此,构建大鲵皮肤cDNA文库、筛选免疫基因可为大鲵皮肤活性物质开发、免疫抗病机制研究、生长发育、代谢研究以及资源保护研究奠定基础。本研究以健康大鲵背部皮肤为材料,采用SMART技术构建大鲵皮肤cDNA文库,后经过文库质量检测,ESTs测序及分析（Cross-match、Phrap软件、基因功能注释、COG软件归类、免疫基因筛选）,并对获得的大鲵肌动蛋白相关2/3复合物-5样蛋白（Arp2/3 complex subunit 5-like, Arpc5l）和胞质动力蛋白轻链(Dynein light chain, LC8-type 2, Dynll2等2个全长基因进行了序列分析和组织表达研究。获得如下结果:（1）、大鲵初级文库库容量为1.50x106 cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。（2）、从随机挑选的400个阳性克隆中获得325个有效ESTs,经BLAST比对,其中214条ESTs为已知基因序列,214条ESTs可归为9大类:一般功能（7.5%）;生命代谢（14.0%）;细胞骨架及结构形成（13.0%）;细胞周期调控（2.5%）;分泌型活性物质（31.3%）;基因重组和修复（7.0%）;蛋白翻译后修饰（5.6%）;信号转导（12.6%）;功能未确定基因（6.5%）。（3）、大鲵皮肤中有两类基因表达量较高,一类为免疫相关基因:Galectin-3（15.4%）、OGN（1.5%）、Ovoinhibitor precursor（1.2%）、Mcp（1.2%）、Fth1（0.9%）、TribSPI（0.9%）;另一类为代谢基因:CO II（,4.3%）、NADH dehydrogenase subunit 2（1.2%）、COⅢ（0.9%）、Triosephosphate isomerase（0.9%）等。这与大鲵皮肤具有的免疫、呼吸、渗透压平衡等多种生理功能相一致。（4）、初步筛选鉴定出7个主要免疫基因:Galectin-3、Ovoinhibitor precursor、Mcp、Fth1、TribSPI、ANXA1和Tβ-4,且表达量均超过0.5%。此外,促炎症因子MIF、Tubulin;肽基脯氨酰顺反异构酶类似物基因以及肉质性状相关基因CSTA1、CSTB等也有分布。（5）、分离获得了Arpc5l及Dynll2全长cDNA序列。大鲵Arpc5l全长699 bp,编码153个氨基酸;无信号肽,二级结构以α-螺旋为主,该蛋白具有肌动蛋白活性,能参与微管运动且和癌细胞的转移相关;大鲵Arpc5l编码蛋白具有强保守性;Arpc5l在大鲵皮肤、肌肉、肠、肝脏、脾脏、肺、胃以及肾脏组织中广泛表达,且在肾、肠、肌肉中的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）。大鲵Dynll2全长682 bp,编码104个氨基酸。编码蛋白中碱性氨基酸含量较高,无信号肽,二级结构以α-螺旋为主;该蛋白具有马达蛋白活性;大鲵Dynll2编码蛋白具有很强的保守性。Dynll2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。本研究中分离出的Arpc5l、Dynll2基因均能参与微管运动且和癌细胞的转移相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 两栖动物资源概况及cDNA 文库构建技术
• 1.1 两栖动物生物资源概况及变化趋势
• 1.2 两栖动物皮肤活性物质
• 1.2.1 抗菌肽
• 1.2.2 生物胺（碱）与神经毒素
• 1.2.3 蛋白酶类抑制剂
• 1.2.4 凝集素
• 1.2.5 激肽类物质
• 1.2.6 神经介素及其他
• 1.3 cDNA 文库构建技术及其应用
• 1.3.1 cDNA 文库的构建技术
• 1.3.2 cDNA 文库类型
• 1.3.3 cDNA 文库在功能基因研究中的应用
• 1.4 Arp2/3 complex 蛋白家族与动力蛋白
• 1.4.1 Arp2/3 complex 蛋白家族
• 1.4.2 动力蛋白Dynein
• 1.5 本研究的目的及意义
• 试验研究
• 第二章 大鲵皮肤cDNA 文库构建及ESTs 序列分析
• 2.1 材料与仪器试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 载体和菌株
• 2.1.4 组织样品
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA、mRNA 的提取
• 2.2.2 cDNA 双链合成
• 2.2.3 限制性SfiⅠA 和SfiⅠB 酶切反应
• 2.2.4 使用Spin Column 除去短链cDNA
• 2.2.5 载体连接
• 2.2.6 质粒转化
• 2.2.7 ESTs 测序及序列生物信息学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 皮肤总RNA
• 2.3.2 cDNA 文库的构建和质量鉴定
• 2.3.3 ESTs 测序与分析
• 2.3.4 文库 ESTs COG 分类及大鲵皮肤基因特性分析
• 2.3.5 免疫相关基因
• 2.4 讨论
• 2.4.1 cDNA 文库质量
• 2.4.2 大鲵皮肤基因表达特性
• 2.4.3 大鲵皮肤免疫相关基因
• 2.4.4 其他基因
• 2.5 小结
• 第三章 大鲵Arpc5l、Dynll2基因的生物信息学分析 及组织表达研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 Arpc5l、Dynll2 基因的生物信息学分析
• 3.1.3 大鲵 Arpc5l 基因的组织表达研究
• 3.1.4 大鲵 Dynll2 基因的组织表达研究
• 3.2 结果
• 3.2.1 大鲵 Arpc5l 基因的分离与生物信息学分析
• 3.2.2 大鲵 Dynll2 基因的分离与生物信息学分析
• 3.2.3 大鲵 Arpc5l 基因的组织表达
• 3.2.4 大鲵 Dynll2 基因的组织表达
• 3.3 讨论
• 3.3.1 Arpc5l 基因
• 3.3.2 Dynll2 基因
• 3.4 小结
• 结论
• 创新点
• 进一步研究内容
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介