论文摘要
MicroRNA（miRNA）是一类分布广泛,大小约为22个核苷酸的内源性非编码RNA,参与基因的转录后调控。部分miRNA基因分布在基因组中的基因间区,而另一些miRNA基因位于蛋白编码基因的内含子中。目前,对miRNA基因转录的了解仍十分有限,而对位内含子区域的miRNA及其与宿主基因的转录关系,更是知之甚少。有意思的是,有些miRNA基因位于宿主基因的可变剪接区域。其中,由于宿主基因的可变转录起始位点,果蝇miR-281-1/2基因位于宿主ODA基因的内含子区或5’UTR区。本论文主要研究了miR-281-1/2的转录,探讨了位于内含子区的miRNA与其宿主基因可变转录起始位点之间的关系,并进一步开展了miRNA基因的启动子分析。本项研究对更好地理解miRNA基因的转录调控,具有重要的意义。一、果蝇miR-281基因的转录及全长分析RT-PCR成功扩增出miR-281-1/2的前体,进一步利用RACE技术克隆了miR-281的全长。RACE结果表明,miR-281可能有3个转录起始位点,分别为TSS1,TSS2和TSS3。TSS1上游350bp有一个TATA盒,所有转录本具有相同的3’端,并在3’端有多核腺苷酸加尾信号（AATAAA）。实验证实,miR-281并不是从宿主基因ODA基因的内含子区加工形成,而是具有自身的独立转录本。通过与UCSC基因组数据库比对,发现三个转录起始位点的保守性均比较高。二、miR-281的二级结构,靶标预测和分子进化分析Dme-miR-281基因属于mir-46家族,包括两个前体,四个（三种）成熟体。两前体在茎区只有一个核苷酸的差异,而环区有13个核苷酸的差异。MiRBase中dme-miR-281有7个同源基因,对应于8个miRNA基因成熟体,分别属于6个物种。利用RNAfold和Mfold软件,分别对miR-281-1/2的前体和初级转录本的二级结构进行了预测,证实三个初级转录本均可形成茎环结构。利用PicTar和miRanda软件预测miR-281-1/2的靶标,发现miR-281-1有83个靶标mRNA基因,miR-281-2有69个靶标mRNA基因,miR-281-1和miR-281-2拥有共同的61个靶标基因。UCSC数据库比对结果证实,其他16个物种中存在dme-miR-281的同源序列,但miR-281前体的重复事件只发生在黑腹果蝇及其近缘物种中（果蝇科）。利用MrBayes构建分子系统进化树发现,miR-281-1和miR-281-2处于两个不同的分支。三、miR-281的表达谱及与ODA基因选择性剪接的关系利用RT-PCR的方法研究了ODA基因3个剪切变体和miR-281在不同龄期的表达谱。结果表明,3个剪切体RA、RB、RC在果蝇的每个龄期都表达,而miR-281仅在3龄幼虫,蛹和成虫期表达。荧光定量PCR结果表明,RA和RC的丰度较高,在各个龄期的变化很大。RB和miR-281的表达量较低,miR-281在不同龄期没有明显的区别。这些结果表明,ODA基因的可变转录起始位点对处于其内含子区的miR-281的转录没有明显的影响。EST分析的结果与定量PCR相对表达量的结果一致,匹配到RA和RC的EST远远多于RB和miR-281。四、miR-281基因的启动子及Myc转录因子的免疫共沉淀分析利用TRANSFAC数据库预测发现,TSS1,TSS2和TSS3附近有重要的转录因子结合位点如:Myc,C/EBP,CAD等等。TSS1上下游有两个Myc结合位点。通过染色质免疫共沉淀实验,证明Myc结合于miR-281基因启动子区,可能参与miR-281的转录调节,这也间接证明了miR-281的独立转录。UCSC数据库比对结果显示,两个Myc转录因子结合位点的保守性较高。将TSS1上游1020 bp及下游412 bp的区域作为可能的启动子区,构建了pMiR-281-GFP载体,转染果蝇S2细胞,并利用CuSO4促进转录表达,结果未能发现明显的绿色荧光。分析可能存在多个原因,一是miR-281启动子的启动效率太低,以致观察不到GFP发出的荧光;二是果蝇S2细胞不表达miR-281;三是选择构建载体的启动子区域不是真正的启动子区。五、多重转录起始位点的转录效率分析利用随机引物进行反转录的cDNA为模板,进行定量PCR来分析miR-281基因不同转录起始位点的转录效率。在3龄幼虫期,与转录本1比较,转录本2是转录本1的0.97倍,在成虫期,转录本2是转录本1的0.83倍。这一结果表明,TSS1和TSS2具有相似的转录效率。转录本3在3龄幼虫期和成虫期分别是转录本1的4.34倍和1.33倍,表明TSS3的转录效率比TSS1和TSS2都高,但TSS3随着果蝇的不同发育阶段,转录效率有所变化。
论文目录
相关论文文献
标签：转录论文; 果蝇论文; 多重转录起始位点论文; 重复事件论文;