茉莉酸和一氧化氮在诱发苦参悬浮细胞合成苦参碱中的协同作用研究

论文摘要

植物细胞中活性成分含量低是制约植物细胞培养技术产业化应用的一个主要因素,要实现植物细胞培养大规模生产药用活性物质,首要条件是提高植物细胞中次级代谢产物的含量。研究表明植物次级代谢产物的合成受细胞内信号转导系统的调控,然而目前对植物次生代谢产物合成的信号转导机制知之甚少。茉莉酸(JA)和一氧化氮(NO)是植物体内两种常见的信号分子,研究表明JA和NO在植物抗病和抗逆中具有重要作用。为了考察JA和NO对植物细胞次生代谢产物合成的影响,我们以苦参悬浮细胞为材料,研究了JA和NO对苦参悬浮细胞中苦参碱合成的影响,并对JA和NO在诱发苦参碱合成中的互作机理进行了初步研究,主要实验结果如下：1.茉莉酸对苦参悬浮细胞苦参碱合成的诱发作用考查了不同浓度JA对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响,结果表明JA对苦参碱合成的影响依赖于JA的浓度。高浓度JA(≥50lμmol/L)对苦参碱合成具有促进作用；而低浓度JA(≤10μmol/L)处理对苦参碱合成无影响。2.一氧化氮对苦参悬浮细胞苦参碱合成的诱发作用以SNP(硝普钠)为NO供体,考查了NO对苦参悬浮细胞苦参碱合成的影响,结果表明NO对苦参碱合成的诱发作用具有明显的剂量效应。低浓度NO (≤0.1mmol/L SNP)处理对苦参悬浮细胞苦参碱合成无促进作用,而高浓度NO (0.5mmol/L SNP)可以显著提高苦参碱产量。3.茉莉酸和一氧化氮在诱发苦参悬浮细胞苦参碱合成中的协同作用虽然10μmol/L JA和0.05mmol/L SNP单独处理均不影响苦参悬浮细胞苦参碱的合成,但是以lO μmol/L JA和0.05mmol/L SNP混合处理苦参悬浮细胞时,悬浮细胞苦参碱的产量却明显提高,表明NO和JA在诱发苦参碱合成中具有特殊的协同作用。4.苦参细胞内茉莉酸和一氧化氮之间的互催化作用为了探讨JA和NO在诱发苦参碱合成中的协同作用机理,我们测定了NO处理下苦参细胞JA生物合成关键酶LOX活性及JA含量,结果表明NO (0.05mmol/L SNP)处理可以提高细胞LOX活性及JA含量,提示NO可以激活细胞JA生物合成途径促进JA合成；与此类似,10μmol/LJA处理下,苦参细胞NOS(一氧化氮合酶)活性及NO含量亦显著提高,说明JA也可以促进细胞NOS活性的增强并提高NO水平。上述实验结果表明,苦参细胞内NO和JA之间具有特殊的互催化作用,通过这种互催化作用可以提高细胞内JA及NO水平。5.茉莉酸和一氧化氮诱发苦参碱合成的协同作用依赖于二者之间的互催化作用为了考查JA和NO诱发苦参悬浮细胞苦参碱合成的协同作用与JA和NO互催化作用之间的关系,本文测定了JA及NO生物合成抑制剂对JA和NO之间的互催化作用及诱发苦参碱合成协同作用的影响。试验结果表明,JA及NO生物合成抑制剂在抑制JA和NO之间互催化作用的同时也抑制了JA和NO诱发苦参碱合成的协同作用。因此,推测JA和NO诱发苦参碱合成的协同作用依赖于二者之间的互催化作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 植物细胞培养技术生产天然产物的历史与现状
• 1.1.1 目前常见的植物细胞培养技术
• 1.1.2 提高培养细胞目的物质产量技术
• 1.1.3 结语
• 1.2 植物细胞次生代谢产物信号调控技术
• 1.3 本论文的研究思路和主要研究内容
• 第2章 苦参愈伤组织的诱导以及悬浮培养条件的优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料、试剂和实验仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 苦参愈伤组织的诱导
• 2.3.2 苦参细胞悬浮培养条件的优化
• 2.3.3 苦参悬浮细胞鲜重、干重的测定
• 2.3.4 苦参碱产量的测定
• 2.3.5 苦参悬浮细胞系的建立与细胞生长周期的确定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 苦参愈伤组织的形成
• 2.4.2 苦参悬浮细胞培养条件的优化
• 2.4.3 苦参悬浮细胞中苦参碱产量的测定
• 2.4.4 苦参悬浮细胞体系的建立与细胞生长周期的确定
• 2.5 讨论
• 第3章 茉莉酸处理对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料、试剂和实验仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 苦参悬浮细胞的培养
• 3.3.2 苦参悬浮细胞的茉莉酸处理
• 3.3.3 苦参悬浮细胞干重和苦参碱产量的测定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 茉莉酸处理时间对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 3.4.2 茉莉酸处理浓度对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 3.5 讨论
• 第4章 一氧化氮处理对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料、试剂和实验仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 苦参悬浮细胞的培养
• 4.3.2 试剂溶液的配制
• 4.3.3 苦参悬浮细胞的硝普钠处理
• 4.3.4 一氧化氮含量的测定
• 4.3.5 苦参碱产量的测定
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 硝普钠分解后释放的一氧化氮浓度
• 4.4.2 一氧化氮处理时间对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 4.4.3 一氧化氮处理浓度对苦参悬浮细胞苦参碱产量的影响
• 4.4.4 cPTIO对一氧化氮提高苦参悬浮液细胞苦参碱产量的抑制作用
• 4.5 讨论
• 第5章 茉莉酸和一氧化氮在诱发苦参悬浮细胞苦参碱合成中的协同作用
• 5.1 前言
• 5.2 材料、试剂和实验仪器
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 苦参悬浮细胞的培养
• 5.3.2 试剂和溶液的配制
• 5.3.3 苦参悬浮细胞的茉莉酸和一氧化氮处理
• 5.4 实验结果
• 5.5 讨论
• 第6章 苦参细胞内茉莉酸和一氧化氮之间的互催化作用
• 6.1 前言
• 6.2 材料、试剂和实验仪器
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 主要仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 一氧化氮合酶（NOS）活力测定
• 6.3.2 脂氧合酶（LOX）活性测定方法
• 6.3.3 茉莉酸含量测定方法
• 6.3.4 一氧化氮含量测定方法
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 NO供体对苦参悬浮细胞茉莉酸含量的影响
• 6.4.2 NO供体对苦参悬浮细胞LOX活性的影响
• 6.4.3 NO供体及抑制剂对苦参悬浮细胞LOX活性和茉莉酸含量的影响
• 6.4.4 茉莉酸诱发苦参悬浮细胞一氧化氮迸发
• 6.4.5 茉莉酸处理对苦参悬浮细胞NOS活性的诱发作用
• 6.4.6 PBITU对茉莉酸诱发苦参悬浮细胞一氧化氮迸发的抑制作用
• 6.5 讨论
• 第7章 茉莉酸和一氧化氮诱发苦参碱合成的协同作用依赖于二者之间的互催化作用
• 7.1 前言
• 7.2 材料、试剂和仪器
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 主要试剂
• 7.2.3 主要仪器
• 7.3 实验方法
• 7.3.1 苦参悬浮细胞的培养
• 7.3.2 试剂和溶液的配制
• 7.3.3 苦参悬浮细胞的实验处理
• 7.4 实验结果
• 7.5 讨论
• 第8章 结论
• 参考文献
• 附表 MS母液的配制
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢