论文摘要
研究背景肿瘤抗原可以被免疫细胞识别,人体淋巴细胞在肿瘤微环境内能直接杀伤肿瘤细胞,其杀伤过程的各阶段改变均可见到,但这种杀伤作用并不能使肿块缩小,消失。针对肿瘤免疫治疗方法在临床上的效果并不理想。抗肿瘤免疫反应效应细胞的功能在执行阶段受到抑制。肿瘤能逃逸机体的免疫排斥,其机制尚未完全明了。已有学者提出了肿瘤微环境的概念,比较合理地解释了肿瘤逃逸机体免疫排斥的机制。肿瘤微环境是指肿瘤在发生发展过程中所处的内环境,主要包括肿瘤细胞、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成,肿瘤微环境是抗肿瘤免疫效应阶段的执行场所。肿瘤宿主可以启动抗肿瘤免疫应答,产生免疫效应细胞,在执行免疫效应时进入肿瘤微环境,肿瘤微环境中存在多种因素使肿瘤内部的免疫状态为抑制性的,从而抑制了免疫效应细胞的功能。增强患者全身免疫功能不能改变肿瘤微环境的免疫抑制状态。只有设法解除肿瘤微环境的各种免疫抑制因素,机体的抗肿瘤免疫及生物学治疗才能奏效。慢性炎症反应可导致DNA损伤进而可引起肿瘤,目前长期炎症刺激肿瘤的发生已经成为定论。但炎症反应导致的免疫细胞募集也产生不利于肿瘤发展的机制。急性炎症反应可以募集免疫细胞特别是APC和T细胞,对治疗肿瘤有益。与宿主不是同一种属的抗原物质称为异种抗原。通常情况下,异种抗原的免疫原性比较强,容易引起较强的免疫应答。天然抗体介导的超急性排斥反应是临床开展异种移植的最大障碍。异种器官移植后可出现由天然抗体介导的、补体依赖的细胞毒效应,导致超急性排斥反应的发生。已经有学者将体内预先存在的天然抗体应用到肿瘤的免疫治疗中。人红细胞膜含有多种抗原,包括各种多糖类抗原、肽类抗原等。人红细胞膜对于小鼠是异种物质,小鼠体内可能存在针对人红细胞膜抗原的天然抗体。瘤内注射人红细胞膜后可能出现由天然抗体介导的、补体依赖的排斥效应,导致与超急性排斥反应类似的情况发生。即使小鼠体内无或存在较低水平的天然抗体,但异种抗原可刺激小鼠的免疫系统,产生诱导抗体,继而导致补体依赖的细胞毒作用,表现为类似迟发型异种排斥反应效应。同时小鼠体内T细胞可识别异种抗原,产生的免疫应答也可引起急性或慢性异种排斥效应。以上各种机制均有可能在小鼠肿瘤内部发生免疫反应,产生具有趋化活性的补体片段,趋化各种免疫细胞进入肿瘤内部,产生明显的炎症反应,使肿瘤内部的免疫细胞、抗原呈递细胞增加,分泌各种细胞因子,进而激活更多的免疫细胞,非特异性的炎症反应可引起肿瘤细胞的坏死,进而发生特异性的抗肿瘤免疫反应,逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态,达到抗肿瘤的目的。研究目的本研究应用对于小鼠为异种的A型人红细胞膜进行瘤内注射,了解这种异种抗原瘤内注射的方法是否能够在肿瘤内部引起明显的炎症反应进而产生抗肿瘤效果。同时了解经过A型人红细胞膜瘤内注射后小鼠S180肉瘤内部肿瘤微环境免疫状态的变化,初步探讨这种免疫治疗方法抗肿痛效应的可能机制。寻找一种简单有有效的肿瘤免疫治疗方法。实验方法1.低渗溶解法制作A型人红细胞膜。35只健康昆明小鼠按体重随机分为2大组,免疫组20只,不免疫组15只。A型2%人红细胞悬液腹腔内注射免疫昆明小鼠,每次0.2ml,每周两次,共两周。检测小鼠血清中抗A型抗体效价。复制昆明小鼠S180肉瘤皮下瘤模型。免疫组小鼠其中5只皮下注射S180肉瘤细胞时同时注射0.1ml浓度为5mg/ml人A型红细胞膜0.9%NaCl悬液。成瘤后未免疫组小鼠选择10只分为两组:瘤内注射生理盐水组（对照组）,5只;瘤内注射A型红细胞膜组,5只;免疫组小鼠选择10只分为两组:瘤内注射生理盐水组,5只;瘤内注射A型红细胞膜组,5只。应用5mg/ml人A型红细胞膜0.9%NaCl悬液或0.9%NaCl0.1ml瘤内注射,连续注射5天。注射前及注射第3天、第7天、第14天用游标卡尺测量各组小鼠皮下瘤最大长径及垂直宽径长度,计算肿瘤体积。2.70只健康昆明小鼠免疫及复制小鼠S180肉瘤皮下瘤模型同前。小鼠按体重随机分为4组:未免疫瘤内注射生理盐水组（对照组）,15只;未免疫瘤内注射A型人红细胞膜组,15只;免疫后序贯瘤内注射生理盐水组,15只;免疫后序贯瘤内注射A型人红细胞膜组,15只。瘤内注射A型人红细胞膜或生理盐水同前。注射第14天每组颈椎脱臼法处死6只小鼠,取出皮下肿瘤,留取小块组织行病理学检查,了解肿瘤组织内肿瘤坏死、及炎症细胞浸润情况。每组剩余9只小鼠继续观察小鼠生存情况。3.不连续密度梯度离法心分离各组小鼠肿瘤组织内的淋巴细胞及肿瘤细胞,Annexin-V/PI法检测肿瘤细胞凋亡率,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达及肿瘤浸润淋巴细胞CD3+CD8+、CD3+CD4+及CD3+CD4+CD25+亚群变化,ELISA法检测肿瘤内IL-2、IFN-γ、TNF-α、C5a含量变化。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,计算凋亡指数,免疫组化法行肿瘤组织中血管内皮细胞CD34染色,计算微血管密度改变。4.统计方法:（1）不同分组不同时间肿瘤体积应用重复测量数据的方差分析,不同时间点各处理组肿瘤体积与对照组比较采用one-way ANOVA分析及LSD组间比较,如方差不齐则选择近似F检验Welch法,及Dunnett’s T3组间比较。（2）各组小鼠瘤重、肿瘤内细胞因子含量、肿瘤内淋巴细胞亚群、肿瘤细胞凋亡率、C5a含量、肿瘤内微血管密度、肿瘤细胞凋亡指数、肿瘤细胞MHC-I类抗原表达率比较采用2×2析因设计的方差分析,单独效应的分析应用独立样本的t检验。（3）各组小鼠生存期间应用.Kaplan-Meier法进行统计学检验。以P＜0.05为差异有显著性。实验结果1.检测2%人红细胞悬液腹腔免疫小鼠血清内抗A血型抗体效价,抗体效价为1:128。2.随着时间的变化不同组小鼠肿瘤体积逐渐增加（P＜0.01）。各分组处理因素对肿瘤体积增加的影响有显著差异（P＜0.01）,并且与肿瘤体积的增加有交互作用（P＜0.01）,即各分组处理因素对抑制肿瘤生长的影响是不同的。处理前各组肿瘤体积间无显著差异（P＞0.05）。处理第14天各组肿瘤体积间具有显著差异（P＜0.01）,A型人红细胞膜与肿瘤细胞同时接种组、免疫后A型人红细胞膜瘤内注射组、A型人红细胞膜瘤内注射组肿痛体积与对照组的差别均具有统计学意义（P＜0.05）,肿瘤体积均小于对照组。而免疫后生理盐水瘤内注射组与对照组比较无显著差别（P＞0.05）。3.A型人红细胞免疫使肿瘤重量降低（P＜0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜可显著降低肿瘤重量（P＜0.01）,是否免疫和是否注射A型人红细胞膜两种因素之间不具有交互作用（P＞0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜降低肿瘤重量不受是否免疫因素的影响。4.瘤内注射A型人红细胞膜后肿瘤组织镜下可见肿瘤细胞坏死、淋巴细胞等炎症细胞浸润,免疫后的小鼠肿瘤组织坏死及炎症细胞浸润明显。对照组和免疫后瘤内注射生理盐水组小鼠肿瘤组织可见少量肿瘤坏死及炎症细胞浸润。5.对照组小鼠中位生存期24.0（18.156 29.844）天,A型人红细胞膜瘤内注射组小鼠中位生存期29.0（23.456 35.544）天,免疫后痛内生理盐水注射组小鼠中位生存期25.0（18.070 31.930）天,免疫后瘤内注射A型人红细胞膜组小鼠中位生存期29.0（23.156 34.844天）。各组小鼠生存期差别无统计学意义（P＞0.05）。6.是否给与小鼠A型人红细胞免疫对肿瘤细胞凋亡率无显著影响（P＞0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜可明显诱导肿瘤细胞凋亡（P＜0.01）,瘤内注射A型人红细胞膜诱导肿瘤细胞凋亡不受是否免疫的影响（P＞0.05）。7.是否给与小鼠A型人红细胞免疫对肿瘤细胞MHC-Ⅰ类抗原表达率无显著影响（P＞0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜可显著上调肿瘤细胞MHC-Ⅰ类抗原的表达（P＜0.01）,这种上调MHC-Ⅰ类抗原的作用与免疫因素无关（P＞0.05）。8.瘤内注射A型人红细胞膜或免疫因素对肿瘤内CD3+CD8+CTI细胞的数量无显著影响（P＞0.05）,而对CD3+CD4+Th细胞数量的影响具有统计学意义（P≤0.01）,但两种因素不具有交互作用（P＞0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜或腹腔免疫小鼠均可提高肿瘤内CD3+CD4+Th细胞的数量,以免疫后瘤内注射A型人红细胞膜组小鼠肿瘤内CD3+CD4+Th细胞的数量最高。两种因素均可降低肿瘤内CD3+CD4+CD25+Treg细胞的数量（P＜0.05）,但不具有交互作用（P＞0.05）,以免疫后瘤内注射A型人红细胞膜组小鼠肿痛内CD3+CD4+CD25+Treg细胞的数量最低。9.A型人红细胞免疫及A型人红细胞膜瘤内注射两种处理因素均可以使肿瘤内部IL-2含量增加（P＜0.05）,但两种因素对肿瘤内部IL-2含量的影响无交互作用（P＞0.05）。免疫后瘤内注射A型人红细胞膜组小鼠肿瘤内IL-2含量最高。两种因素对肿瘤内部IFN-γ、TNF-α含量均无显著影响（P＞0.05）。免疫及瘤内注射A型人红细胞膜14天均不能使肿瘤内IFN-γ、TNF-α含量明显增加。10.免疫因素对肿瘤内部C5a含量的影响无统计学意义（P＞0.05）,瘤内注射A型人红细胞膜可增加瘤内C5a的含量（P＜0.01）,两种因素无交互作用（P＞0.05）。11.免疫因素对肿瘤细胞凋亡指数无显著影响（P＞0.05）,而瘤内注射A型人红细胞膜可增加肿瘤细胞凋亡指数（P＜0.01）。两种处理因素无交互作用（P＞0.05）。瘤内注射A型人红细胞膜组凋亡细胞多,且多存在与坏死细胞的周边。而痛内注射生理盐水组凋亡细胞量相对少,散在。12.是否免疫对肿瘤内微血管密度无明显影响（P＞0.05）,而痛内注射A型人红细胞膜可减少肿瘤内微血管的数量（P＜0.01）。两种处理因素无交互作用（P＞0.05）。结论1.异种红细胞膜瘤内注射可以抑制小鼠S180肉瘤肿瘤生长。2.异种红细胞膜瘤内注射可引起小鼠S180肉瘤肿瘤内发生明显的坏死、炎症细胞浸润,细胞凋亡增加。3.异种红细胞膜抗小鼠S180肉瘤的机制与肿瘤内部补体激活、IL-2含量增加、肿痛细胞表面MHC-Ⅰ类抗原表达上调、CD3+CD4+Th细胞数量增加、CD3+CD4+CD25+Treg细胞数量及微血管密度降低有关。