论文摘要
第一部分XIAP、Smac、Caspase-3在胃癌组织中的表达及其相关性研究目的探讨凋亡相关基因XIAP、Smac和Caspase-3在人胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测80例胃癌组织和40例癌旁正常胃粘膜中XIAP、Smac、Caspase-3的表达情况。结果80例胃癌组织中XIAP、Smac、Caspase-3的阳性率分别为90%（72/80）、67.5%（54/80）和62.5%（50/80）。XLAP阳性表达与胃癌分化程度负相关（P＜0.05）;Smac、Caspase-3与分化程度正相关（P＜0.05）。XLAP、Smac、Caspase-3表达在肠型和弥漫型胃癌之间有显著性差异（P＜0.05）,与淋巴结转移相关（P＜0.05）,但与胃癌部位、大小、浸润深度无关。胃癌组织中XIAP、Smac的表达分别与Caspase-3呈负相关、正相关。40例正常胃粘膜中XIAP弱阳性表达6例（15%）,而Smac、Caspase-3的阳性率分别高达92.5%（37/40）、90%（36/40）。结论随胃癌恶性程度的增加,XIAP的表达增高,而Smac和Caspase-3表达降低,可能参与胃癌的发生、发展,是评估胃癌预后的潜在指标。第二部分瞬时转染外源性Smac基因对胃癌细胞株化疗敏感性的调控作用目的细胞凋亡异常是肿瘤耐药性产生的关键因素之一。Smac是新近发现的一种凋亡调节基因,在介导化疗药物对肿瘤细胞的诱导凋亡效应中起重要作用。本研究旨在观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响,为进一步改善胃癌化疗效果奠定基础。方法采用脂质体GeneSHUTTLE-40介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞株MKN-45,RT-PCR和western blot法检测癌细胞中Smac的表达;选用顺铂、丝裂霉素分别处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑盐（MTF）比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄影,Annexin V-FITC和碘化丙锭双染色流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。结果同未转染对照组比较,转染外源性Smac基因后MKN-45细胞Smac的mRNA和蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）,各浓度顺铂、丝裂霉素处理24h后细胞生长抑制率分别增加10.10%～23.80%（P＜0.01）、10.01%～15.86%（P＜0.01）,细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,细胞凋亡比率分别增加6.7%～20.2%（P＜0.01）、5.4%～13.2%（P＜0.01）。结论转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达,能提高MKN-45对化疗药物的敏感性,是改善胃癌化疗效果的潜在途径。第三部分稳定过表达Smac基因胃癌细胞株的建立及其化疗敏感性研究目的探讨稳定过表达Smac基因对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法采用脂质体将Smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac及空白载体pcDNA3.1转染入胃癌细胞株MKN-45,G418筛选获得抗性亚克隆细胞株,RT-PCR和western blot检测癌细胞Smac基因表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、克隆形成实验检测丝裂霉素（MMC）对癌细胞的生长抑制效率。结果建立分别稳定表达Smac基因、新霉素抗性基因（neo）的胃癌亚克隆细胞株MKN-45/Smac、MKN-45/neo。RT-PCR和western blot证实MKN-45/Smac细胞的Smac mRNA及蛋白表达水平均显著高于MKN-45、MKN-45/neo（P＜0.01）。10μg/ml MMC作用24h后,MKN-45、MKN-45/neo细胞生长抑制率分别为27.85%、28.12%,而MKN-45/Smac则高达43.71%（P＜0.01）;同MKN-45、MKN-45/neo细胞株比较,MKN-45/Smac的克隆形成能力分别降低了14.07%（P＜0.01）、15.13%（P＜0.01）。结论稳定转染Smac基因使其在胃癌细胞株中过表达,能显著提高癌细胞对MMC的敏感性,为改善胃癌化疗效果奠定了实验基础。第四部分稳定转染外源性Smac基因对胃癌细胞凋亡通路的影响目的探讨稳定过表达Smac基因对胃癌细胞凋亡的影响。方法体外培养胃癌细胞株MKN-45、MKN-45/neo、MKN-45/Smac,以丝裂霉素（MMC）作为凋亡诱导因子,采用台盼兰活细胞拒染法检测癌细胞体外生长活性,透射电镜、吖啶橙-溴化乙啶荧光染色法、末端TdT酶标记技术（TUNEL）观察癌细胞凋亡及比率;western blot、比色法检测细胞内caspase-3表达和活性。结果10μg/ml MMC作用6～24 h后,与MKN-45细胞比较,MKN-45/Smac细胞生长活性减弱10.0%～30.8%（P＜0.01）,部分MKN-45/Smac细胞发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率增高21.2%（P＜0.01）。MMC作用后,MKN-45/Smac细胞内caspase-3的表达和活性均较MKN-45细胞显著增强（P＜0.01）。结论胃癌细胞中Smac基因的过表达,能提高MMC作用后细胞中caspase-3的表达和活性,显著诱导癌细胞凋亡,为调控胃癌细胞凋亡活性提供了新的途径。第五部分下调XIAP表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响目的观察下调XIAP基因表达对胃癌细胞化疗敏感性的影响。方法构建XIAP基因反义真核表达载体,稳定转染胃癌细胞株MKN-45,RT-PCR和western blot法检测癌细胞XIAP基因表达。选用顺铂、丝裂霉素分别处理转染前后的胃癌细胞,采用MTT比色法、克隆形成抑制实验检测癌细胞体外生长活性;透射电镜、流式细胞术、TUNEL检测癌细胞凋亡及比率;western blot和比色法检测细胞内caspase-3蛋白表达和活性水平。结果RT-PCR和western blot证实,稳定转染反义XIAP基因的胃癌细胞MKN-45的XIAP mRNA和蛋白表达水平分别降低84.75%（P＜0.01）、89.75%（P＜0.01）。各浓度顺铂、丝裂霉素处理24h后,转染反义XIAP基因的MKN-45细胞生长抑制率分别增加7.3%～25.3%（P＜0.01）,12.3%～16.3%（P＜0.01）。透射电镜下可见部分细胞发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率分别为34.1%和32.5%,显著高于未转染对照组MKN-45细胞（凋亡率为14.2%,P＜0.05）。与MKN-45细胞比较,稳定转染反义XIAP基因的MKN-45细胞内caspase-3表达水平增高2.45倍（P＜0.01）,活性水平提高3.68倍（P＜0.01）。结论通过反义RNA技术下调XIAP基因表达,能提高癌细胞中caspase-3的表达和活性,增强化疗药物对癌细胞的诱导凋亡作用。第六部分姜黄素对胃癌细胞株IAP家族及Smac基因表达的影响目的观察姜黄素（Curcumin）对人胃癌细胞株IAP家族和Smac基因表达的影响,探讨姜黄素诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。方法10～40μmol/L姜黄素分别处理胃癌细胞株MKN-45 6～24 h后,MTF比色法检测癌细胞生长活性,末端TdT酶标记技术和DNA Ladder检测细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应fRT-PCR)和western blot法检测IAP家族（Survivin、XIAP）和Smac基因表达;比色法检测癌细胞Caspase-3活性改变。结果同未加药对照组比较,各浓度姜黄素作用后癌细胞生长明显减慢,抑制率为12.18%～68.15%（P＜0.01）,部分细胞呈现典型凋亡形态学改变,凝胶电泳可见“梯形”条带,凋亡率为9.24%～28.12%（P＜0.01）;Survivin、XIAP基因mRNA和蛋白水平显著下调（P＜0.01）,而Smac基因表达增强（P＜0.01）,癌细胞Caspase-3活性增强2.27～6.67倍（P＜0.01）。结论姜黄素可显著诱导胃癌MKN-45细胞凋亡,通过上调Smac、下调Survivin和XIAP基因表达,进而活化Caspase-3是其作用机制之一。