基于酪蛋白的纳米粒子制备及其应用的研究

论文摘要

由两亲性共聚物组成的胶束已经被开发用作水相体系中的疏水药物载体。用合成高分子作为构建药物载体的材料一直是研究的重点。相比合成高分子而言,天然高分子具有许多独特的性质,它们既可以包埋疏水药物,又可以包埋亲水药物,所以天然高分子也可以是构建药物载体的好材料。更值得一提的是,天然高分子有较高的安全性。用天然高分子通过简便易行的绿色化学方法构建药物载体,可以有效地避免合成化学试剂和有机溶剂的使用,这对载体在生物医药工业中的应用非常有利。酪蛋白（casein）是牛奶中的主要组成成分,它是一组蛋白的磷酸盐,由四种成分组成:αs1-,αs2-,β-和κ-酪蛋白,这四种成分在牛奶中的质量比约为3:0.8:3:1,它们的分子量在19000-25000Da范围内。这四种酪蛋白都是两亲性的蛋白质,没有确定的结构。在食品工业中,酪蛋白在多个方面具有应用价值,比如乳化,与水的结合,与油脂的结合,以及质构等。这些优点使得酪蛋白可以作为理想的基材来构造纳米载体,用于药物输送系统。Maillard反应是一种天然无毒的反应,它在食品的运输、烹饪和储存过程中都有可能发生。Maillard反应的化学原理已被广泛地研究过,今天我们已经知道这个反应的本质是通过多糖的还原性端羟基与蛋白的氨基（包括端氨基和赖氨酸的氨基）之间的反应将蛋白和多糖连接在一起。Maillard反应产物在许多领域都有广泛的应用,但用于药物包埋的却很少。本论文的工作主要集中在制备基于酪蛋白的纳米粒子并对其应用性进行研究。我们主要制备了两种纳米粒子。一种是通过Maillard反应制备酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物,并通过调节pH值使共聚物自组装形成胶束粒子。该粒子具有疏水性内核,我们用β-胡萝卜素作为模型化合物研究了该粒子对疏水化合物的包埋以及释放性质。另外,由于Maillard反应提高了β-酪蛋白在酸性pH范围内的溶解性,我们也研究了β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物作为酸性体系乳化剂的性能。另一种粒子是利用球状蛋白的凝胶化性质制备的β-酪蛋白-葡聚糖/溶菌酶纳米粒子。该粒子核的亲水性较强,我们用芘的电荷衍生物以及氯金酸作为模型化合物研究了该粒子对极性化合物的包埋行为。论文中所有的纳米粒子的制备都只使用了酸和碱以及乙醇,没有其它化学试剂和溶剂,是一种绿色化学的方法。具体来说,本论文包括了以下五个部分的工作:第一部分是Maillard反应制备酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物及其胶束化行为的研究。我们利用Maillard反应中的Amadori重排制备了两种天然大分子-酪蛋白和葡聚糖的接枝共聚物。所制备的酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物具有pH敏感的可逆性质:在pH值接近酪蛋白等电点时形成以酪蛋白为核,葡聚糖为壳的胶束;在pH值偏离酪蛋白等电点时,胶束会解离。共聚物形成胶束的驱动力是酪蛋白在等电点时由于净电荷为零发生聚集,而共价接枝的葡聚糖阻止了宏观沉淀的形成导致纳米粒子的生成。酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的胶束具有球状外貌,胶束的尺寸取决于共聚物的接枝度,以及所用葡聚糖的分子量等。该胶束具有较强的疏水性,可以包埋芘这样的疏水化合物。第二部分是Maillard反应制备β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物及其乳化性质的研究。我们利用Maillard反应中的Amadori重排反应制备了β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物。当介质pH值处于4.0-5.0范围内,即接近β-酪蛋白的等电点时,β-酪蛋白溶解度降低,β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物可形成胶束。原子力显微镜显示该胶束具有球形外貌。共聚物的接枝度和葡聚糖侧链的长度共同决定了共聚物胶束的尺寸及其可稳定存在的时间。高接枝度的共聚物亲水性较强,以单分子状态存在于溶液中,在pH4.6和8.0都显示出较强的乳化能力。第三部分是对酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和β-胡萝卜素在疏水力诱导下的协同组装行为研究。酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物在pH7.0的水溶液中以单分子状态存在,而β-胡萝卜素难溶于水。我们通过透析法或者蒸发法,将共聚物/β-胡萝卜素混合液的水/乙醇混合溶剂替换成纯水。在此过程中,酪蛋白和β-胡萝卜素通过疏水相互作用形成的复合物的溶解度降低,同时葡聚糖的溶解度上升,最终形成以酪蛋白和β-胡萝卜素复合物为核,葡聚糖为壳的纳米粒子。在纳米粒子的自组装过程中,酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物也同时实现了对β-胡萝卜素的包埋。酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/β-胡萝卜素纳米粒子具有球形外貌,在pH7.0时水合直径约为200nm。该纳米粒子的水溶液具有很高的稳定性,可耐稀释,pH值变化和离子强度变化,可以长时间储存。该纳米粒子也可在干粉状态下保存。包埋在纳米粒子中的β-胡萝卜素可通过胃蛋白酶或胰蛋白酶的水解得到释放。包埋可以提高β-胡萝卜素的抗氧化性,释放后的β-胡萝卜素的反应活性不变。纳米粒子的这些性质使酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物可以成为输送低稳定性的疏水性营养物质和药物的载体。第四部分是β-酪蛋白和溶菌酶的自组装行为的研究。我们用两种蛋白,线状的β-酪蛋白和球状的溶菌酶,制备了β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子。当β-酪蛋白和溶菌酶摩尔比为0.4时,两种蛋白在pH3.0-12.0范围内可形成多分散性的β-酪蛋白/溶菌酶静电复合物胶束。在80℃加热处理复合物胶束溶液后,溶菌酶产生凝胶化而β-酪蛋白被陷在凝胶中并阻止了凝胶的宏观聚集,从而形成β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子。该纳米粒子具有球形外貌,它的粒径受到制备条件,诸如pH值以及β-酪蛋白与溶菌酶的摩尔比等的影响。在pH10.0制备的纳米粒子表面有较多的β-酪蛋白分子,而在pH5.0制备的纳米粒子表面有较多的溶菌酶分子。该纳米粒子具有两性,当pH值低于或高于其零电位点时分别带净正电荷或净负电荷。纳米粒子在pH5.0和10.0溶液中可稳定存在,并且疏水性相对较强。纳米粒子表面的净电荷在水溶液中起到稳定纳米粒子的作用。第五部分是β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和溶菌酶的自组装行为及其包埋性质的研究。我们通过Maillard反应将葡聚糖接枝到β-酪蛋白上,然后利用β-酪蛋白与溶菌酶的静电相互作用以及溶菌酶的凝胶化性质,制备了表面带有葡聚糖壳层的纳米粒子。纳米粒子的尺寸受到β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物接枝度的影响,而纳米粒子的组装效率受到β-酪蛋白与溶菌酶摩尔比的影响。纳米粒子具有球形外貌,粒子核的亲水性较强,粒子的水溶液可在生理pH和离子强度条件下长时间稳定。纳米粒子可以包埋阴离子化合物和金颗粒。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 酪蛋白
• 1.1.1 酪蛋白组成
• 1.1.1.1 αs1-酪蛋白
• 1.1.1.2 αs2-酪蛋白
• 1.1.1.3 β-酪蛋白
• 1.1.1.4 κ-酪蛋白
• 1.1.2 酪蛋白胶束
• 1.1.3 酪蛋白的制备
• 1.1.4 酪蛋白的应用
• 1.1.4.1 食品工业
• 1.1.4.2 生物医药工业
• 1.1.4.3 制革工业
• 1.1.4.4 造纸和木材加工领域
• 1.1.4.5 建筑领域
• 1.1.4.6 纺织领域
• 1.1.4.7 其它方面
• 1.1.5 酪蛋白的改性
• 1.1.5.1 水解改性
• 1.1.5.2 物理和化学改性
• 1.2 Maillard反应
• 1.2.1 历史起源
• 1.2.2 反应机理
• 1.2.2.1 初级反应阶段
• 1.2.2.2 高级反应阶段
• 1.2.2.3 终止反应阶段
• 1.2.3 影响反应的因素
• 1.2.3.1 反应物
• 1.2.3.2 反应pH
• 1.2.3.3 反应温度
• 1.2.3.4 水分含量
• 1.2.3.5 反应时间
• 1.2.3.6 金属离子
• 1.2.3.7 还原剂
• 1.2.3.8 氧化剂
• 1.2.3.9 氯化钠
• 1.2.3.10 反应压力
• 1.2.4 酪蛋白体系的Maillard反应研究
• 1.2.4.1 Maillard反应对牛奶制品的影响
• 1.2.4.2 Maillard反应动力学和反应产物的研究
• 1.2.4.3 Maillard反应产物的功能性
• 1.2.4.4 Maillard反应产物对营养吸收的影响
• 1.3 本论文主要内容
• 参考文献
• 第二章 Maillard反应制备酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物及其胶束化行为的研究
• 2.1 序言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 Maillard反应
• 2.2.3 凝胶电泳分析
• 2.2.4 接枝度分析
• 2.2.4.1 邻苯二甲醛分析法
• 2.2.4.2 三硝基苯磺酸分析法
• 2.2.5 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的胶束化
• 2.2.6 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和壳聚糖在pH6.5时的自组装
• 2.2.7 动态光散射测试
• 2.2.8 ζ-电位测试
• 2.2.9 稳态荧光光谱测试
• 2.2.10 原子力显微镜观察
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酪蛋白在其等电点附近的溶解性
• 2.3.2 通过Maillard反应制备酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物
• 2.3.3 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的接枝度分析
• 2.3.4 pH值对酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的ζ-电位的影响
• 2.3.5 pH诱导的酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的胶束化行为
• 2.3.6 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的接枝度对胶束的水合直径,多分散系数以及散射光强的影响
• 2.3.7 葡聚糖的分子量以及葡聚糖与酪蛋白的摩尔比对胶束在pH4.6时的水合直径的影响
• 2.3.8 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束在pH4.6的解离浓度研究
• 2.3.9 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束在水溶液中的稳定性
• 2.3.10 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束的原子力显微镜图像
• 2.3.11 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束的疏水性
• 2.3.12 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和壳聚糖在pH6.5时的自组装
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Maillard反应制备β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物及其乳化性质的研究
• 3.1 序言
• 3.2 试验部分
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 β-酪蛋白在酸性pH值范围内的溶解性
• 3.2.3 Maillard反应
• 3.2.4 凝胶电泳分析
• 3.2.5 接枝度分析
• 3.2.5.1 邻苯二甲醛（OPA）分析法
• 3.2.5.2 三硝基苯磺酸（TNBS）分析法
• 3.2.6 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的胶束化
• 3.2.7 超滤离心分析
• 3.2.8 动态光散射测试
• 3.2.9 稳态荧光光谱测试
• 3.2.10 原子力显微镜观察
• 3.2.11 乳化能力测试
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 β-酪蛋白在酸性pH下的溶解性
• 3.3.2 通过Maillard反应制备β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物
• 3.3.3 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的接枝度分析
• 3.3.3.1 TNBS分析法
• 3.3.3.2 OPA分析法
• 3.3.4 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物在酸性pH下的胶束化行为
• 3.3.5 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的接枝度对共聚物在pH4.6胶束化的影响
• 3.3.6 葡聚糖分子量以及葡聚糖与β-酪蛋白摩尔比对共聚物在pH4.6胶束化的影响
• 3.3.7 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的超滤离心分析
• 3.3.8 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束的热力学稳定性
• 3.3.9 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物胶束的原子力显微镜图像
• 3.3.10 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的乳化能力测试
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和β-胡萝卜素在疏水作用力诱导下的协同组装行为研究
• 4.1 序言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的制备
• 4.2.3 纳米粒子的制备
• 4.2.3.1 透析法
• 4.2.3.2 蒸发法
• 4.2.4 β-胡萝卜素在胃蛋白酶或胰蛋白酶水解作用下的释放
• 4.2.5 β-胡萝卜素包埋量的定量分析
• 3氧化的性质'>4.2.6 β-胡萝卜素抗FeCl₃氧化的性质
• 4.2.7 凝胶电泳分析
• 4.2.8 动态光散射测试
• 4.2.9 ζ-电位测试
• 4.2.10 X-射线粉末衍射
• 4.2.11 差示扫描量热分析
• 4.2.12 原子力显微镜观察
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/β-胡萝卜素纳米粒子的制备
• 4.3.2 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/β-胡萝卜素纳米粒子的结构表征
• 4.3.2.1 pH值对纳米粒子ζ-电位的影响
• 4.3.2.2 纳米粒子的差示扫描量热分析
• 4.3.2.3 纳米粒子的X-射线衍射分析
• 4.3.2.4 纳米粒子的原子力显微镜观察
• 4.3.3 酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/β-胡萝卜素纳米粒子的稳定性
• 4.3.4 β-胡萝卜素包埋量的分析
• 4.3.5 β-胡萝卜素在蛋白酶水解作用下的释放
• 4.3.6 包埋对β-胡萝卜素抗氧化性的影响
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 β-酪蛋白和溶菌酶自组装行为的研究
• 5.1 序言
• 5.1.1 聚电解质复合物综述
• 5.1.1.1 聚电解质及其类型
• 5.1.1.2 聚电解质在水溶液中的行为
• 5.1.1.3 聚电解质复合物的研究历史
• 5.1.1.4 聚电解质复合物的反应方程
• 5.1.1.5 聚电解质复合物的形成机理
• 5.1.1.6 聚电解质复合物的结构模型
• 5.1.1.7 聚电解质复合物的类型
• 5.1.1.8 聚电解质复合物的制备
• 5.1.1.9 影响聚电解质复合物的因素
• 5.1.1.10 聚电解质复合物在生物医药领域的应用
• 5.1.2 溶菌酶简介
• 5.1.3 球状蛋白分子的凝胶化
• 5.1.4 溶菌酶和β-酪蛋白之间的相互作用
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 材料与试剂
• 5.2.2 β-酪蛋白/溶菌酶胶束和纳米粒子的制备
• 5.2.3 动态光散射测试
• 5.2.4 ζ-电位测试
• 5.2.5 稳态荧光光谱测试
• 5.2.6 原子力显微镜测试
• 5.2.7 透射电镜测试
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的制备
• 5.3.1.1 β-酪蛋白/溶菌酶复合物胶束
• 5.3.1.2 pH对制备β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的影响
• 5.3.1.3 β-酪蛋白与溶菌酶的摩尔比对制备β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的影响
• 5.3.1.4 热处理温度对制备β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的影响
• 5.3.1.5 热处理时间对制备β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的影响
• 5.3.2 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的表征
• 5.3.2.1 pH值对β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的ζ-电位的影响
• 5.3.2.2 pH值对β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子直径的影响
• 5.3.2.3 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的形貌观察
• 5.3.2.4 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的亲/疏水性研究
• 5.3.2.5 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的形成机理
• 5.3.3 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的稳定性
• 5.3.3.1 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的pH稳定性研究
• 5.3.3.2 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的存放稳定性研究
• 5.3.3.3 β-酪蛋白/溶菌酶纳米粒子的制备浓度研究
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物和溶菌酶的自组装行为及其包埋性质的研究
• 6.1 序言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 材料与试剂
• 6.2.2 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的制备
• 6.2.3 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/溶菌酶纳米粒子的制备
• 6.2.4 极性模型化合物的包埋量分析
• 6.2.5 金颗粒的包埋
• 6.2.6 动态光散射测试
• 6.2.7 ζ-电位测试
• 6.2.8 纳米粒子的亲/疏水性测试
• 6.2.9 原子力显微镜测试
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/溶菌酶纳米粒子的制备
• 6.3.1.1 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物的接枝度对纳米粒子制备的影响
• 6.3.1.2 β-酪蛋白与溶菌酶的摩尔比对纳米粒子制备的影响
• 6.3.2 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/溶菌酶纳米粒子的表征
• 6.3.2.1 pH值对纳米粒子ζ-电位的影响
• 6.3.2.2 纳米粒子的形貌观察
• 6.3.2.3 纳米粒子的亲/疏水性研究
• 6.3.3 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/溶菌酶纳米粒子的稳定性研究
• 6.3.4 β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物/溶菌酶纳米粒子对极性化合物的包埋研究
• 6.3.4.1 芘的阴离子衍生物的包埋研究
• 6.3.4.2 芘的阳离子衍生物的包埋研究
• 6.3.4.3 金颗粒的包埋研究
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 作者简介
• 后记